Abstract The human brain vasculature is of vast medical importance: its dysfunction causes disability and death, and the specialized structure it forms—the blood-brain barrier—impedes treatment of nearly all brain disorders. Yet, no molecular atlas of the human brain vasculature exists. Here, we develop Vessel Isolation and Nuclei Extraction for Sequencing (VINE-seq) to profile the major human brain vascular and perivascular cell types through 143,793 single-nucleus transcriptomes from 25 hippocampus and cortex samples of 17 control and Alzheimer’s disease (AD) patients. We identify brain region-enriched pathways and genes divergent between humans and mice, including those involved in disease. We describe the principles of human arteriovenous organization, recapitulating a gradual endothelial and punctuated mural cell continuum; but discover that many zonation and cell-type markers differ between species. We discover two subtypes of human pericytes, marked by solute transport and extracellular matrix (ECM) organization; and define perivascular versus meningeal fibroblast specialization. In AD, we observe a selective vulnerability of ECM-maintaining pericytes and gene expression patterns implicating dysregulated blood flow. With an expanded survey of brain cell types, we find that 30 of the top 45 AD GWAS genes are expressed in the human brain vasculature, confirmed in situ . Vascular GWAS genes map to endothelial protein transport, adaptive immune, and ECM pathways. Many are microglia-specific in mice, suggesting an evolutionary transfer of AD risk to human vascular cells. Our work unravels the molecular basis of the human brain vasculature, informing our understanding of overall brain health, disease, and therapy.

ABSTRACT In response to the health crisis presented by the COVID-19 pandemic, rapid development of safe and effective vaccines that elicit durable immune responses is imperative. Recent reports have raised the concern that antibodies in COVID-19 convalescent patients may not be long lasting and thus even these individuals may require vaccination. Vaccine candidates currently in clinical testing have focused on the SARS-CoV-2 wild type spike (S) protein (S-WT) as the major antigen of choice and while pre-clinical and early clinical testing have shown that S elicits an antibody response, we believe the optimal vaccine candidate should be capable of inducing robust, durable T-cell responses as well as humoral responses. We report here on a next generation bivalent human adenovirus serotype 5 (hAd5) vaccine capable of inducing immunity in patients with pre-existing adenovirus immunity, comprising both an S sequence optimized for cell surface expression (S-Fusion) and a conserved nucleocapsid (N) antigen designed to be transported to the endosomal subcellular compartment, with the potential to generate durable immune protection. Our studies suggest that this bivalent vaccine is optimized for immunogenicity as evidenced by the following findings: (i) The optimized S-Fusion displayed improved S receptor binding domain (RBD) cell surface expression compared to S-WT where little surface expression was detected; (ii) the expressed RBD from S-Fusion retained conformational integrity and recognition by ACE2-Fc; (iii) the viral N protein modified with an enhanced T-cell stimulation domain (ETSD) localized to endosomal/lysosomal subcellular compartments for MHC I/II presentation; and (iv) these optimizations to S and N (S-Fusion and N-ETSD) generated enhanced de novo antigen-specific B cell and CD4+ and CD8+ T-cell responses in antigen-naive pre-clinical models. Both the T-cell and antibody immune responses to S and N demonstrated a T-helper 1 (Th1) bias. The antibody responses were neutralizing as demonstrated by two independent SARS-CoV-2 neutralization assays. Based on these findings, we are advancing this next generation bivalent hAd5 S-Fusion + N-ETSD vaccine as our lead clinical candidate to test for its ability to provide robust, durable cell-mediated and humoral immunity against SARS-CoV-2 infection. Further studies are ongoing to explore utilizing this vaccine construct in oral, intranasal, and sublingual formulations to induce mucosal immunity in addition to cell-mediated and humoral immunity. The ultimate goal of an ideal COVID-19 vaccine is to generate long-term T and B cell memory.

ABSTRACT We have developed a dual-antigen COVID-19 vaccine incorporating genes for a modified SARS-CoV-2 spike (S-Fusion) protein and the viral nucleocapsid (N) protein with an Enhanced T-cell Stimulation Domain (N-ETSD) with the potential to increase MHC class I/II responses. The adenovirus serotype 5 platform used, hAd5 [E1-, E2b-, E3-], previously demonstrated to be effective in the presence of Ad immunity, can be delivered in an oral formulation that overcomes cold-chain limitations. The hAd5 S-Fusion + N-ETSD vaccine was evaluated in rhesus macaques showing that a subcutaneous prime followed by oral boosts elicited both humoral and Th1 dominant T-cell responses to both S and N that protected the upper and lower respiratory tracts from high titer (1 x 10 6 TCID 50 ) SARS-CoV-2 challenge. Notably, viral replication was inhibited within 24 hours of challenge in both lung and nasal passages, becoming undetectable within 7 days post-challenge. ONE SENTENCE SUMMARY hAd5 spike + nucleocapsid SC prime/oral boost vaccine elicits humoral and T-cell responses and protects rhesus macaques from SARS-CoV-2 challenge.

ABSTRACT In response to the need for an efficacious, thermally-stable COVID-19 vaccine that can elicit both humoral and cell-mediated T-cell responses, we have developed a dual-antigen human adenovirus serotype 5 (hAd5) COVID-19 vaccine in formulations suitable for subcutaneous (SC), intranasal (IN), or oral delivery. The vaccine expresses both the SARS-CoV-2 spike (S) and nucleocapsid (N) proteins using an hAd5 platform with E1, E2b, and E3 sequences deleted (hAd5[E1-, E2b-, E3-]) that is effective even in the presence of hAd5 immunity. In the vaccine, S is modified (S-Fusion) for enhanced cell-surface display to elicit humoral responses and N is modified with an Enhanced T-cell Stimulation Domain (N-ETSD) to direct N to the endosomal/lysosomal pathway to increase MHC I and II presentation. Initial studies using subcutaneous (SC) prime and SC boost vaccination of CD-1 mice demonstrated that the hAd5 S-Fusion + N-ETSD vaccine elicits T-helper cell 1 (Th1) dominant T-cell and humoral responses to both S and N. We then compared SC to IN prime vaccination with either an SC or IN boost post-SC prime and an IN boost after IN prime. These studies reveal that IN prime/IN boost is as effective at generating Th1 dominant humoral responses to both S and N as the other combinations, but that the SC prime with either an IN or SC boost elicits greater T cell responses. In a third study to assess the power of the two routes of delivery when used together, we used a combined SC plus IN prime with or without a boost and found the combined prime alone to be as effective as the combined prime with either an SC or IN boost in generating both humoral and T-cell responses. The findings here in CD-1 mice demonstrate that combined SC and IN prime-only delivery has the potential to provide broad immunity – including mucosal immunity – against SARS-CoV-2 and supports further testing of this delivery approach in additional animal models and clinical trials.

Abstract Localized stimulation of the inner retinal neurons for high-acuity prosthetic vision requires small pixels and minimal cross-talk from neighboring electrodes. Local return electrodes within each pixel limit crosstalk, but can over-constrain the electric field, thus precluding efficient stimulation with subretinal pixels smaller than 50 μm. Here we demonstrate high-resolution prosthetic vision based on a novel design of a photovoltaic array, where field confinement is achieved dynamically, leveraging the adjustable conductivity of the diodes under forward bias to turn the designated pixels into transient returns. We validated computational modeling of the field confinement in such an optically-controlled circuit by ex-vivo and in-vivo measurements. Most importantly, using this strategy, we demonstrated that the grating acuity with 40 μm pixels matches the pixel pitch, while with 20 μm pixels, it reaches the 28 μm limit of the natural visual resolution in rats. This method enables customized field shaping based on individual retinal thickness and distance from the implant, paving the way to prosthetic vision with acuity as high as 20/80 in atrophic macular degeneration.

ABSTRACT The highly-transmissible SARS-CoV-2 variants now replacing the first wave strain pose an increased threat to human health by their ability, in some instances, to escape existing humoral protection conferred by previous infection, neutralizing antibodies, and possibly vaccination. Thus, other therapeutic options are necessary. One such therapeutic option that leverages SARS-CoV-2 initiation of infection by binding of its spike receptor binding domain (S RBD) to surface-expressed host cell angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) is an ACE2 ‘decoy’ that would trap the virus by competitive binding and thus inhibit propagation of infection. Here, we used Molecular Dynamic (MD) simulations to predict ACE2 mutations that might increase its affinity for S RBD and screened these candidates for binding affinity in vitro . A double mutant ACE2(T27Y/H34A)-IgG 1 F C fusion protein was found to have very high affinity for S RBD and to show greater neutralization of SARS-CoV-2 in a live virus assay as compared to wild type ACE2. We further modified the double mutant ACE2 decoy by addition of an H374N mutation to inhibit ACE2 enzymatic activity while maintaining high S RBD affinity. We then confirmed the potential efficacy of our ACE2(T27Y/H34A/H374N)-IgG 1 F C Triple Decoy against S RBD expressing variant-associated E484K, K417N, N501Y, and L452R mutations and found that our ACE2 Triple Decoy not only maintains its high affinity for S RBD expressing these mutations, but shows enhanced affinity for S RBD expressing the N501Y or L452R mutations and the highest affinity for S RBD expressing both the E484K and N501Y mutations. The ACE2 Triple Decoy also demonstrates the ability to compete with wild type ACE2 in the cPass™ surrogate virus neutralization in the presence of S RBD with these mutations. Additional MD simulation of ACE2 WT and decoy interactions with S RBD WT or B.1.351 variant sequence S RBD provides insight into the enhanced affinity of the ACE2 decoy for S RBD and reveals its potential as a tool to predict affinity and inform therapeutic design. The ACE2 Triple Decoy is now undergoing continued assessment, including expression by a human adenovirus serotype 5 (hAd5) construct to facilitate delivery in vivo . Summary sentence An ACE2(N27Y/H34A/H374N)-IgG 1 F C fusion protein decoy sustains high affinity to all SARS-CoV-2 spike receptor binding domain (RBD) protein variants tested, shows enhanced affinity for the N501Y and L452R variants, and the highest affinity for combined N501Y and E484K variants.

Abstract Objective To restore central vision in patients with atrophic age-related macular degeneration, we replace the lost photoreceptors with photovoltaic pixels, which convert light into current and stimulate the secondary retinal neurons. Clinical trials demonstrated prosthetic acuity closely matching the sampling limit of the 100 μm pixels, and hence smaller pixels are required for improving visual acuity. However, with smaller flat bipolar pixels, the electric field penetration depth and the photodiode responsivity significantly decrease, making the device inefficient. Smaller pixels may be enabled (1) by increasing the diode responsivity using vertical p-n junctions and (2) by directing the electric field vertically using 3-D electrodes. Here, we demonstrate such novel photodiodes and test the retinal stimulation in a vertical electric field. Approach Arrays of silicon photodiodes of 55, 40, 30, and 20 μm in width, with vertical p-n junctions, were fabricated. The electric field in the retina was directed vertically by a common return electrode at the edge of the devices. Optical and electronic performance of the diodes was characterized in-vitro, and retinal stimulation threshold measured by recording the visually evoked potentials (VEPs) in rats with retinal degeneration. Main results The photodiodes exhibited sufficiently low dark current (<10 pA) and responsivity at 880 nm wavelength as high as 0.51 A/W, with 85% internal quantum efficiency, independent of pixel size. Field mapping in saline demonstrated uniformity of the pixel performance in the array. The full-field stimulation threshold was as low as 0.057±0.029 mW/mm 2 with 10 ms pulses, independent of pixel size. Significance Photodiodes with vertical p-n junctions demonstrated excellent charge collection efficiency independent of pixel size, down to 20 μm. Vertically-oriented electric field provides a stimulation threshold that is independent of pixel size. These results are the first steps in validation of the feasibility of scaling down the photovoltaic pixels for subretinal stimulation.

Abstract In patients blinded by geographic atrophy, subretinal photovoltaic implant with 100µm pixels provided visual acuity closely matching the pixel pitch. However, such flat bipolar pixels cannot be scaled below 75µm, limiting the attainable visual acuity. This limitation can be overcome by shaping the electric field with 3-dimensional electrodes. In particular, elevating the return electrode on top of honeycomb-shaped vertical walls surrounding each pixel extends the electric field vertically and decouples its penetration into tissue from the pixel width. This approach relies on migration of the retinal cells into the honeycomb wells. Here, we demonstrate that the majority of the inner retinal neurons migrate into 25µm deep wells, leaving the third-order neurons, such as amacrine and ganglion cells, outside. This is important for selective stimulation of the second-order neurons to preserve the retinal signal processing in prosthetic vision. Comparable glial response to that with flat implants suggests that migration and separation of the retinal cells by the walls does not cause additional stress. Furthermore, retinal migration into the honeycombs does not negatively affect its electrical excitability.

Clinical results with photovoltaic subretinal prosthesis (PRIMA) demonstrated restoration of sight via electrical stimulation of the interneurons in degenerated retina, with resolution matching the 100 μm pixel size. Since scaling the pixels below 75 μm in the current bipolar planar geometry will significantly limit the penetration depth of the electric field and increase stimulation threshold, we explore the possibility of using smaller pixels based on a novel 3-dimensional honeycomb-shaped design. We assessed the long-term biocompatibility and stability of these arrays in rats by investigating the anatomical integration of the retina with flat and 3D implants and response to electrical stimulation over lifetime – up to 32–36 weeks post-implantation in aged rats. With both flat and 3D implants, signals elicited in the visual cortex decreased after the day of implantation by more than 3-fold, and gradually recovered over the next 12–16 weeks. With 25 μm high honeycomb walls, the majority of bipolar cells migrate into the wells, while amacrine and ganglion cells remain above the cavities, which is essential for selective network-mediated stimulation of the retina. Retinal thickness and full-field stimulation threshold with 40 μm-wide honeycomb pixels were comparable to those with planar devices – 0.05 mW/mm2 with 10 ms pulses. However, fewer cells from the inner nuclear layer migrated into the 20 μm-wide wells, and stimulation threshold increased over 12–16 weeks, before stabilizing at about 0.08 mW/mm2. Such threshold is still significantly lower than 1.8 mW/mm2 with a previous design of flat bipolar pixels, confirming the promise of the 3D honeycomb-based approach to high resolution subretinal prosthesis.

Objective: High-resolution retinal prosthetics offer partial restoration of sight to patients blinded by retinal degenerative diseases through electrical stimulation of the remaining neurons. Decreasing the pixel size enables an increase in prosthetic visual acuity, as demonstrated in animal models of retinal degeneration. However, scaling down the size of planar pixels is limited by the reduced penetration depth of the electric field in tissue. We investigate 3-dimensional structures on top of the photovoltaic arrays for enhanced penetration of electric field to permit higher-resolution implants. Approach: We developed 3D COMSOL models of subretinal photovoltaic arrays that accurately quantify the device electrodynamics during stimulation and verified it experimentally through comparison with the standard (flat) photovoltaic arrays. The models were then applied to optimise the design of 3D electrode structures (pillars and honeycombs) to efficiently stimulate the inner retinal neurons. The return electrodes elevated on top of the honeycomb walls surrounding each pixel orient the electric field inside the cavities vertically, aligning it with bipolar cells for optimal stimulation. Alternatively, pillars elevate the active electrode into the inner nuclear layer, improving proximity to the target neurons. Modelling results informed a microfabrication process of electroplating the 3D electrode structures on top of the existing flat subretinal prosthesis. Main results: Simulations demonstrate that despite the conductive sidewalls of the 3D electrodes being exposed to electrolyte, most of the charge flows via the high-capacitance sputtered Iridium Oxide film that caps the top of the 3D structures. The 24 μm height of the electroplated honeycomb structures was optimised for integration with the inner nuclear layer cells in rat retina, while 35 μm height of the pillars was optimized for penetrating the debris layer in human patients. Release from the wafer and implantation of the 3D arrays demonstrated that they are mechanically robust to withstand the associated forces. Histology demonstrated successful integration of the 3D structures with the rat retina in-vivo. Significance: Electroplated 3D honeycomb structures produce a vertically oriented electric field that offers low stimulation threshold, high spatial resolution and high contrast for the retinal implants with pixel sizes down to 20 μm in width. Pillar electrodes offer an alternative configuration for extending the stimulation past the debris layers. Electroplating of the 3D structures is compatible with the fabrication process of the flat photovoltaic arrays, thereby enabling much more efficient stimulation than in their original flat configuration.