Oncogenic KRas reprograms pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells to states which are highly resistant to apoptosis. Thus, a major preclinical goal is to identify effective strategies for killing PDAC cells. Artesunate (ART) is an anti-malarial that specifically induces programmed cell death in different cancer cell types, in a manner initiated by reactive oxygen species (ROS)-generation. In this study we demonstrate that ART specifically induced ROS- and lysosomal iron-dependent cell death in PDAC cell lines. Highest cytotoxicity was obtained in PDAC cell lines with constitutively-active KRas, and ART did not affect non-neoplastic human pancreatic ductal epithelial (HPDE) cells. We determined that ART did not induce apoptosis or necroptosis. Instead, ART induced ferroptosis, a recently described mode of ROS- and iron-dependent programmed necrosis which can be activated in Ras-transformed cells. Co-treatment with the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 blocked ART-induced lipid peroxidation and cell death, and increased long-term cell survival and proliferation. Importantly, analysis of PDAC patient mRNA expression indicates a dependency on antioxidant homeostasis and increased sensitivity to free intracellular iron, both of which correlate with Ras-driven sensitivity to ferroptosis. Overall, our findings suggest that ART activation of ferroptosis is an effective, novel pathway for killing PDAC cells.

Simultaneous profiling of the spatial distributions of multiple biological molecules at single-cell resolution has recently been enabled by the development of highly multiplexed imaging technologies. Extracting and analyzing biologically relevant information contained in complex imaging data requires the use of a diverse set of computational tools and algorithms. Here, we report the development of a user-friendly, customizable, and interoperable workflow for processing and analyzing data generated by highly multiplexed imaging technologies. The steinbock framework supports image pre-processing, segmentation, feature extraction, and standardized data export. Each step is performed in a reproducible fashion. The imcRtools R/Bioconductor package forms the bridge between image processing and single-cell analysis by directly importing data generated by steinbock . The package further supports spatial data analysis and integrates with tools developed within the Bio-conductor project. Together, the tools described in this workflow facilitate analyses of multiplexed imaging raw data at the single-cell and spatial level.

SUMMARY Highly multiplexed imaging technologies enable spatial profiling of dozens of biomarkers in situ . Standard data processing pipelines quantify cell-specific features and generate object segmentation masks as well as multi-channel images. Therefore, multiplexed imaging data can be visualised across two layers of information: pixel-intensities represent the spatial expression of biomarkers across an image while segmented objects visualise cellular morphology, interactions and cell phenotypes in their microenvironment. Here we describe cytomapper , a computational tool that enables visualisation of pixel- and cell-level information obtained by multiplexed imaging. The package is written in the statistical programming language R, integrates with the image and single-cell analysis infrastructure of the Bioconductor project, and allows visualisation of single to hundreds of images in parallel. Using cytomapper , expression of multiple markers is displayed as composite images, segmentation masks are coloured based on cellular features, and selected cells can be outlined in images based on their cell type, among other functions. We illustrate the utility of cytomapper by analysing 100 images obtained by imaging mass cytometry from a cohort of type 1 diabetes patients and healthy individuals. In addition, cytomapper includes a Shiny application that allows hierarchical gating of cells based on marker expression and visualisation of selected cells in corresponding images. Together, cytomapper offers tools for diverse image and single-cell visualisation approaches and supports robust cell phenotyping via gating.

Abstract Intratumoral immune cells are crucial for tumor control and anti-tumor responses during immunotherapy. Immune cell trafficking into tumors is mediated by chemokines, which are expressed and secreted upon various stimuli and interact with specific receptors. To broadly characterize chemokine expression and function in tumors, we have used multiplex mass cytometry-based imaging of protein markers and RNA transcripts to analyze the chemokine landscape and immune infiltration in metastatic melanoma samples. Tumors that lacked immune infiltration were devoid of most chemokines and exhibited particularly low levels of antigen presentation and inflammation. Infiltrated tumors were characterized by expression of multiple chemokines. CXCL9 and CXCL10 were often localized in patches associated with dysfunctional T cells expressing CXCL13 which was strongly associated with B cell patches and follicles. TCF7 + naïve-like T cells, which predict response to immunotherapy, were enriched in the vicinity of B cell patches and follicles. Our data highlight the strength of RNA and protein co-detection which was critical to deconvolve specialized immune microenvironments in inflamed tumors based on chemokine expression. Our findings further suggest that the formation of tertiary lymphoid structures is accompanied by naïve and naive- like T cell recruitment, which ultimately boosts anti-tumor activity. One sentence summary Inflammatory chemokine milieus in metastatic melanoma are hotspots of T cell dysfunction and CXCL13 expression, which likely guide the recruitment of B cells and the formation of B cell follicles responsible for anti-tumor immunity.

The multiplexity of current antibody-based imaging is limited by the number of reporters that can be detected simultaneously. Compressed sensing can be used to recover high-dimensional information from low-dimensional measurements when the data has a structure that allows sparse representation. Previously, in composite in situ imaging (CISI) of transcriptomic data, compressed sensing leveraged the gene co-regulation structure that allows sparse representation and recovered spatial expression of 37 RNA species with the measurement of 11 fluorescent channels. Here, we extended the compressed sensing framework to protein expression data measured by imaging mass cytometry (IMC). CISI-IMC accurately recovered spatial expression of 16 proteins from the images of 8 composite channels, which in effect expanded the current multiplexity limit of IMC by 8 channels. With this ratio, up to 80 protein markers could be compressed into currently available 40 isotope channels. Training the CISI-IMC framework using data collected on tissues from various locations in the human body enabled the decompression of composite data from a wide range of tissue types. Our work laid the foundation for much higher plex protein imaging by using CISI.

Understanding male fertility requires an in-depth characterisation of spermatogenesis, the developmental process by which male gametes are generated. Spermatogenesis occurs continuously throughout a male's reproductive window and involves a complex sequence of developmental steps, both of which make this process difficult to decipher at the molecular level. To overcome this, we transcriptionally profiled single cells from multiple distinct stages during the first wave of spermatogenesis, where the most mature germ cell type is known. This naturally enriches for spermatogonia and somatic cell types present at very low frequencies in adult testes. Our atlas, available as a shiny app (https://marionilab.cruk.cam.ac.uk/SpermatoShiny), allowed us to reconstruct the three main processes of spermatogenesis: spermatogonial differentiation, meiosis, and spermiogenesis. Additionally, we profiled the chromatin changes associated with meiotic silencing of the X chromosome, revealing a set of genes specifically and strongly repressed by H3K9me3 in the spermatocyte stage, but which escape post-meiotic silencing in spermatids.

How age-associated decline of immune function leads to increased cancer incidence is poorly understood. Here, we have characterized the cellular composition of the γδ T cell pool in peripheral lymph nodes (pLNs) upon ageing. We found that ageing has minimal cell-intrinsic effects on function and global gene expression of γδ T cells, and TCRγδ diversity remained stable. However, ageing altered TCRδ chain usage and clonal structure of γδ T cell subsets. Importantly, IL-17-producing γδ17 T cells dominated the γδ T cell pool of aged mice - mainly due to the selective expansion of Vγ6+ γδ17 T cells and augmented γδ17-polarisation of Vγ4+ T cells. Expansion of the γδ17 T cell compartment was supported by increased Interleukin-7 expression in the T cell zone of old mice. In a Lewis lung cancer model, pro-tumourigenic Vγ6+ γδ17 T cells were exclusively activated in the tumour-draining LN and their infiltration into the tumour correlated with increased tumour size in aged mice. Thus, upon ageing, substantial compositional changes of γδ T cell pool in a dysregulated pLN microenvironment promote tumour growth.

Cell-to-cell transcriptional variability in otherwise homogeneous cell populations plays a crucial role in tissue function and development. Single-cell RNA sequencing can characterise this variability in a transcriptome-wide manner. However, technical variation and the confounding between variability and mean expression estimates hinders meaningful comparison of expression variability between cell populations. To address this problem, we introduce a novel analysis approach that extends the BASiCS statistical framework to derive a residual measure of variability that is not confounded by mean expression. Moreover, we introduce a new and robust procedure for quantifying technical noise in experiments where technical spike-in molecules are not available. We illustrate how our method provides biological insight into the dynamics of cell-to-cell expression variability, highlighting a synchronisation of the translational machinery in immune cells upon activation. Additionally, our approach identifies new patterns of variability across CD4+ T cell differentiation.

Abstract Summary Highly multiplexed imaging enables single-cell-resolved detection of numerous biological molecules in their spatial tissue context. Interactive data visualization of multiplexed imaging data is necessary for quality control and hypothesis examination. Here, we describe cytoviewer , an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of multi-channel images and segmentation masks. The cytoviewer package supports flexible generation of image composites, allows side-by-side visualization of single channels, and facilitates the spatial visualization of single-cell data in the form of segmentation masks. The package operates on SingleCellExperiment, SpatialExperiment and CytoImageList objects and therefore integrates with the Bioconductor framework for single-cell and image analysis. Users of cytoviewer need little coding expertise, and the graphical user interface allows user-friendly navigation. We showcase the functionality of cytoviewer by analysis of an imaging mass cytometry dataset of cancer patients. Availability The cytoviewer package can be installed from Bioconductor via https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytoviewer.html . The development version and further instructions can be found on GitHub at https://github.com/BodenmillerGroup/cytoviewer . We provide an R script to exemplify the usage of cytoviewer in the supplementary information. Supplementary informations Supplementary data are available online.

Animal bodies comprise a diverse array of tissues and cells. To characterise cellular identities across an entire body, we have compared the transcriptomes of single cells randomly picked from dissociated whole larvae of the marine annelid Platynereis dumerilii. We identify five transcriptionally distinct groups of differentiated cells that are spatially coherent, as revealed by spatial mapping. Besides somatic musculature, ciliary bands and midgut, we find a group of cells located at the apical tip of the animal, comprising sensory-peptidergic neurons, and another group composed of non-apical neural and epidermal cells covering the rest of the body. These data establish a basic subdivision of the larval body surface into molecularly defined apical versus non-apical tissues, and support the evolutionary conservation of the apical nervous system as a distinct part of the bilaterian brain.