Abstract Fluorescence imaging is one of the most versatile and widely-used tools in biology 1 . Although techniques to overcome the diffraction barrier were introduced more than two decades ago, and the nominal attainable resolution kept improving 2, 3 , fluorescence microscopy still fails to image the morphology of single proteins or small molecular complexes, either purified or in a cellular context 4, 5 . Here we report a solution to this problem, in the form of o ne-step n anoscale e xpansion (ONE) microscopy. We combined the 10-fold axial expansion of the specimen (1000-fold by volume) with a fluorescence fluctuation analysis 6, 7 to enable the description of cultured cells, tissues, viral particles, molecular complexes and single proteins. At the cellular level, using immunostaining, our technology revealed detailed nanoscale arrangements of synaptic proteins, including a quasi-regular organisation of PSD95 clusters. At the single molecule level, upon main chain fluorescent labelling, we could visualise the shape of individual membrane and soluble proteins. Moreover, conformational changes undergone by the ∼17 kDa protein calmodulin upon Ca 2+ binding were readily observable. We also imaged and classified molecular aggregates in cerebrospinal fluid samples from Parkinson’s Disease (PD) patients, which represents a promising new development towards improved PD diagnosis. ONE microscopy is compatible with conventional microscopes and can be performed with the software we provide here as a free, open-source package. This technology bridges the gap between high-resolution structural biology techniques and light microscopy, and provides a new avenue for discoveries in biology and medicine.

Abstract When populations become isolated, members of these populations can diverge genetically over time. This leads to genetic differences between these populations that increase over time if the isolation persists. This process can be counteracted by gene flow, i.e. when genes are exchanged between populations. In order to study the speciation processes when gene flow is present, isolation-with-migration methods have been developed. These methods typically assume that the ranked topology of the species history is already known. However, this is often not the case and the species tree is therefore of interest itself. For the inference of species trees, it is in turn often necessary to assume that there is no gene flow between co-existing species. This assumption, however, can lead to wrongly inferred speciation times and species tree topologies. We here introduce a new method that allows inference of the species tree while explicitly modelling the flow of genes between coexisting species. By using Markov chain Monte Carlo sampling, we co-infer the species tree alongside evolutionary parameters of interest. By using simulations, we show that our newly introduced approach is able to reliably infer the species trees and parameters of the isolation-with-migration model from genetic sequence data. We then use this approach to infer the species history of the mosquitoes from the Anopheles gambiae species complex. Accounting for gene flow when inferring the species history suggests a slightly different speciation order and gene flow than previously suggested.

Abstract Reticulate species evolution, such as hybridization or introgression, is relatively common in nature. In the presence of reticulation, species relationships can be captured by a rooted phylogenetic network, and orthologous gene evolution can be modeled as bifurcating gene trees embedded in the species network. We present a Bayesian approach to jointly infer species networks and gene trees from multilocus sequence data. A novel birth-hybridization process is used as the prior for the species network, and we assume a multispecies network coalescent (MSNC) prior for the embedded gene trees. We verify the ability of our method to correctly sample from the posterior distribution, and thus to infer a species network, through simulations. To quantify the power of our method, we reanalyze two large datasets of genes from spruces and yeasts. For the three closely related spruces, we verify the previously suggested homoploid hybridization event in this clade; for the yeast data, we find extensive hybridization events. Our method is available within the BEAST 2 add-on SpeciesNetwork , and thus provides an extensible framework for Bayesian inference of reticulate evolution.

ABSTRACT The combination of biclustering and large-scale gene expression data holds a promising potential for inference of the condition specific functional pathways/networks. However, existing biclustering tools do not have satisfied performance on high-resolution RNA-sequencing (RNA-Seq) data, majorly due to the lack of ( i ) a consideration of high sparsity of RNA-Seq data, e.g., the massive zeros or lowly expressed genes in the data, especially for single-cell RNA-Seq (scRNA-Seq) data, and ( ii ) an understanding of the underlying transcriptional regulation signals of the observed gene expression values. Here we presented a novel biclustering algorithm namely QUBIC2, for the analysis of large-scale bulk RNA-Seq and scRNA-Seq data. Key novelties of the algorithm include ( i ) used a truncated model to handle the unreliable quantification of genes with low or moderate expression, ( ii ) adopted the mixture Gaussian distribution and an information-divergency objective function to capture shared transcriptional regulation signals among a set of genes, ( iii ) utilized a Core-Dual strategy to identify biclusters and optimize relevant parameters, and ( iv ) developed a size-based P -value framework to evaluate the statistical significances of all the identified biclusters. Our method validation on comprehensive data sets of bulk and single cell RNA-seq data suggests that QUBIC2 had superior performance in functional modules detection and cell type classification compared with the other five widely-used biclustering tools. In addition, the applications of temporal and spatial data demonstrated that QUBIC2 can derive meaningful biological information from scRNA-Seq data. The source code for QUBIC2 can be freely accessed at https://github.com/maqin2001/qubic2 .

Summary Current clinical treatment for neurodegenerative diseases and neural injuries falls short of success, and one primary reason is that neurons in the mammalian central nervous system (CNS) lose their regeneration ability as they mature. Previous studies indicated that the regeneration ability of neurons is governed by complex signaling networks involving many genes. Therefore, here we investigated the roles of Ezh2, a histone methyltransferase, in regulation of mammalian axon regeneration at the epigenetic level. We found that Ezh2 level was gradually downregulated in the mouse nervous system during maturation but significantly upregulated in mature sensory neurons during spontaneous axon regeneration in the peripheral nerve system (PNS), suggesting its role in supporting axon regeneration. Indeed, Ezh2 loss-of-function in sensory neurons impaired PNS axon regeneration in vitro and in vivo . In contrast, overexpression of Ezh2 in retinal ganglion cells in the CNS induced optic nerve regeneration after optic nerve injury in both methyltransferase-dependent and -independent manners. Mechanistic exploration with multiomics sequencing, together with functional analyses, revealed that Ezh2 supported axon regeneration by systematically silencing the transcription of genes regulating synaptic function and axon regeneration inhibitory signaling, while broadly activating factors promoting axon regeneration. Our study not only reveals that Ezh2 coordinates axon regeneration via epigenetically regulating multiple key regenerative pathways, but also suggests that modulating chromatin accessibility is a promising strategy to promote CNS axon regeneration.

Abstract Bayesian molecular dating is widely used to study evolutionary timescales. This procedure usually involves phylogenetic analysis of nucleotide sequence data, with fossil-based calibrations applied as age constraints on internal nodes of the tree. An alternative approach is Bayesian total-evidence dating, which involves the joint analysis of molecular data from present-day taxa and morphological data from both extant and fossil taxa. Part of its appeal stems from the fossilized birth-death process, which provides a model of lineage diversification for the prior on the tree topology and node times. However, total-evidence dating faces a number of considerable challenges, especially those associated with fossil sampling and evolutionary models for morphological characters. We conducted a simulation study to evaluate the performance of total-evidence dating with the fossilized birth-death model. We simulated fossil occurrences and the evolution of nucleotide sequences and morphological characters under a wide range of conditions. Our analyses show that fossil occurrences have a greater influence than the degree of among-lineage rate variation or the number of morphological characters on estimates of node times and the tree topology. Total-evidence dating generally performs well in recovering the relationships among extant taxa, but has difficulties in correctly placing fossil taxa in the tree and identifying the number of sampled ancestors. The method yields accurate estimates of the origin time of the fossilized birth-death process and the ages of the root and crown group, although the precision of these estimates varies with the probability of fossil occurrence. The exclusion of morphological characters results in a slight overestimation of node times, whereas the exclusion of nucleotide sequences has a negative impact on inference of the tree topology. Overall, our results provide a detailed view of the performance of total-evidence dating, which will inform further development of the method and its application to key questions in evolutionary biology.

Abstract Liver fibrosis is the excessive accumulation of extracellular matrix that can progress to cirrhosis and failure if untreated (1). The mechanisms of fibrogenesis are multi-faceted and remain elusive with no approved antifibrotic treatments available (2). Here we use single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) of the adult zebrafish liver to study the molecular and cellular dynamics of the liver at a single-cell level and demonstrate the value of the adult zebrafish as a model for studying liver fibrosis. scRNA-seq reveals transcriptionally unique populations of hepatic cell types that comprise the zebrafish liver. Joint clustering with human liver scRNA-seq data demonstrates high conservation of transcriptional profiles and human marker genes in zebrafish cell types. Human and zebrafish hepatic stellate cells (HSCs), the driver cell in liver fibrosis (3), specifically show conservation of transcriptional profiles and we uncover Colec11 as a novel, conserved marker for zebrafish HSCs. To demonstrate the power of scRNA-seq to study liver fibrosis, we performed scRNA-seq on our zebrafish model of a pediatric liver disease with characteristic early, progressive liver fibrosis caused by mutation in mannose phosphate isomerase (MPI) (4–6). Comparison of differentially expressed genes from human and zebrafish MPI mutant HSC datasets demonstrated similar activation of fibrosis signaling pathways and upstream regulators. CellPhoneDB analysis revealed important receptor-ligand interactions within normal and fibrotic states. This study establishes the first scRNA-seq atlas of the adult zebrafish liver, highlights the high degree of similarity to the human liver, and strengthens its value as a model to study liver fibrosis. Significance Statement To our knowledge, this is the first single-cell characterization of the adult zebrafish liver, both in a normal physiologic state and in the setting of liver fibrosis. We identify transcriptionally distinct zebrafish liver cell populations and a high degree of transcriptional conservation between human and zebrafish cells across the majority of hepatic cell types. Furthermore, using this scRNA transcriptome, we identify key signaling pathways in zebrafish HSCs that are replicated in human HSCs and implicated in the regulation of liver fibrosis. Our work provides a useful resource that can be used to aid research using the zebrafish liver and asserts the usefulness of the adult zebrafish to study liver fibrosis.

Abstract Motivation Mixture regression has been widely used as a statistical model to untangle the latent subgroups of the sample population. Traditional mixture regression faces challenges when dealing with: 1) outliers and versatile regression forms; and 2) the high dimensionality of the predictors. Here, we develop an R package called RobMixReg, which provides comprehensive solutions for robust, flexible as well as high dimensional mixture modeling. Availability and Implementation RobMixReg R package and associated documentation is available at CRAN: https://CRAN.R-project.org/package=RobMixReg .

Abstract The Pigskin architecture and physiology are similar to these of humans. Thus, the pig model is valuable for studying skin biology and testing therapeutics for skin diseases. The single-cell RNA sequencing technology allows quantitatively analyzing cell types, cell states, signaling, and receptor-ligand interactome at single-cell resolution and at high throughput. scRNA-Seq has been used to study mouse and human skins. However, studying pigskin with scRNA-Seq is still rare. Here we described a robust method for isolating and cryo-preserving pig single cells for scRNA-Seq. We showed that pigskin could be efficiently dissociated into single cells with high cell viability using the Miltenyi Human Whole Skin Dissociation kit and the Miltenyi gentleMACS Dissociator. Also, we showed that the subsequent single cells could be cryopreserved using DMSO without causing additional cell death, cell aggregation, or changes in gene expression profiles. Using the developed protocol, we were able to identify all the major skin cell types. The protocol and results from this study will be very valuable for the skin research scientific community.

Abstract In situ imaging of biomolecular location with nanoscale resolution enables mapping of the building blocks of life throughout biological systems in normal and disease states. Expansion microscopy (ExM), by physically enlarging specimens in an isotropic fashion, enables nanoimaging on standard light microscopes. Key to ExM is the equipping of different kinds of molecule, with different kinds of anchoring moiety, so they can all be pulled apart by polymer swelling. Here we present a multifunctional anchor, an acrylate epoxide, that enables multiple kinds of molecules ( e.g., proteins and RNAs) to be equipped with anchors in a single experimental step. This reagent simplifies ExM protocols and greatly reduces cost (by 2-10 fold for a typical multiplexed ExM experiment) compared to previous strategies for equipping RNAs with anchors. We show that this unified ExM (uniExM) protocol can be used to preserve and visualize RNA transcripts, proteins in biologically relevant ultrastructure, and sets of RNA transcripts in patient-derived xenograft (PDX) cancer tissues, and can support the visualization of other kinds of biomolecular species as well. Thus, uniExM may find many uses in the simple, multimodal nanoscale analysis of cells and tissues.