This study describes the generation of knock-in mouse lines that express optogenetic activators or silencers in a CRE recombinase–dependent manner, and demonstrates the reliability and utility of these tools with in vivo and ex vivo light-induced activation and silencing of neuronal activity. Cell type–specific expression of optogenetic molecules allows temporally precise manipulation of targeted neuronal activity. Here we present a toolbox of four knock-in mouse lines engineered for strong, Cre-dependent expression of channelrhodopsins ChR2-tdTomato and ChR2-EYFP, halorhodopsin eNpHR3.0 and archaerhodopsin Arch-ER2. All four transgenes mediated Cre-dependent, robust activation or silencing of cortical pyramidal neurons in vitro and in vivo upon light stimulation, with ChR2-EYFP and Arch-ER2 demonstrating light sensitivity approaching that of in utero or virally transduced neurons. We further show specific photoactivation of parvalbumin-positive interneurons in behaving ChR2-EYFP reporter mice. The robust, consistent and inducible nature of our ChR2 mice represents a significant advance over previous lines, and the Arch-ER2 and eNpHR3.0 mice are to our knowledge the first demonstration of successful conditional transgenic optogenetic silencing. When combined with the hundreds of available Cre driver lines, this optimized toolbox of reporter mice will enable widespread investigations of neural circuit function with unprecedented reliability and accuracy.

Overcoming the limits of the microscope The resolution of a light microscope is limited. Physicists have long since worked out what these limits are and which parameters determine the spatial resolution. Many groups have nevertheless made numerous attempts to overcome these resolution limits. Rather than improving the power and quality of the microscope, Chen et al. instead expanded the biological specimens under study (see the Perspective by Dodt). They introduced a polymer gel into fixed cells and tissues and chemically induced swelling of the polymer by almost two orders of magnitude. They could then produce much higher-resolution images of their samples, which included the mouse hippocampus. Science , this issue p. 543 ; see also p. 474

The experimental use of microbial opsins — light-sensitive ion channels — has ushered in a revolution in neuroscience, as they make it possible to modulate the activity of genetically targeted neurons in response to exogenous light. Now, Ed Boyden and colleagues have screened archaebacteria, bacteria, plants and fungi for opsins with novel properties and have found a fundamentally new mechanism for neural control: light-driven proton pumping. Although protons are not used natively as charge carriers by neural systems, light-driven proton pumping by archaerhodopsin-3 from Halorubrum sodomense mediates powerful neural silencing in response to light. And a proton pump from the fungus Leptosphaeria maculans enables neural silencing by blue light. The use of these reagents will facilitate the shutdown of neural circuits with light as a tool for studying the role of neural circuits in behaviour and pathology. If the activity of genetically specified neurons is silenced in a temporally precise fashion, the roles of different cell classes in neural processes can be studied. Members of the class of light-driven outward proton pumps are now shown to mediate powerful, safe, multiple-colour silencing of neural activity. The gene archaerhodopsin-3 (Arch) enables near 100% silencing of neurons in the awake brain when virally expressed in the mouse cortex and illuminated with yellow light. The ability to silence the activity of genetically specified neurons in a temporally precise fashion would provide the opportunity to investigate the causal role of specific cell classes in neural computations, behaviours and pathologies. Here we show that members of the class of light-driven outward proton pumps can mediate powerful, safe, multiple-colour silencing of neural activity. The gene archaerhodopsin-3 (Arch)1 from Halorubrum sodomense enables near-100% silencing of neurons in the awake brain when virally expressed in the mouse cortex and illuminated with yellow light. Arch mediates currents of several hundred picoamps at low light powers, and supports neural silencing currents approaching 900 pA at light powers easily achievable in vivo. Furthermore, Arch spontaneously recovers from light-dependent inactivation, unlike light-driven chloride pumps that enter long-lasting inactive states in response to light. These properties of Arch are appropriate to mediate the optical silencing of significant brain volumes over behaviourally relevant timescales. Arch function in neurons is well tolerated because pH excursions created by Arch illumination are minimized by self-limiting mechanisms to levels comparable to those mediated by channelrhodopsins2,3 or natural spike firing. To highlight how proton pump ecological and genomic diversity may support new innovation, we show that the blue–green light-drivable proton pump from the fungus Leptosphaeria maculans4 (Mac) can, when expressed in neurons, enable neural silencing by blue light, thus enabling alongside other developed reagents the potential for independent silencing of two neural populations by blue versus red light. Light-driven proton pumps thus represent a high-performance and extremely versatile class of ‘optogenetic’ voltage and ion modulator, which will broadly enable new neuroscientific, biological, neurological and psychiatric investigations.

An increasingly powerful approach for studying brain circuits relies on targeting genetically encoded sensors and effectors to specific cell types. However, current approaches for this are still limited in functionality and specificity. Here we utilize several intersectional strategies to generate multiple transgenic mouse lines expressing high levels of novel genetic tools with high specificity. We developed driver and double reporter mouse lines and viral vectors using the Cre/Flp and Cre/Dre double recombinase systems and established a new, retargetable genomic locus, TIGRE, which allowed the generation of a large set of Cre/tTA-dependent reporter lines expressing fluorescent proteins, genetically encoded calcium, voltage, or glutamate indicators, and optogenetic effectors, all at substantially higher levels than before. High functionality was shown in example mouse lines for GCaMP6, YCX2.60, VSFP Butterfly 1.2, and Jaws. These novel transgenic lines greatly expand the ability to monitor and manipulate neuronal activities with increased specificity.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiI2NTYzNzNhZmE2MGI5NWI4ZDE3MjNlY2RlZjk0MzdiYSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4MjY4MTM1fQ.PpjP_UHxkXdfCILXG8d3N5UMZym6WxE2Z7K3TBjmFJmC2rZ3MBLSzsdT85oNLYywZQOSEZ4UA2jXN6uPv2rVb5zQ-JMRrufAMnsg3E-Pa3NnLoEkenYA0lM656zzJND7RmRc429iikBmxLG7h0arfreFHtS7lOVlZVZHlWAWIDIoJQmh7OH3qSPYn1wRmIZiX_38btOYd4VvUxYz3qm4IrgWvwJvCUDPELE3AUdoVDjuqScKc8QqfZv216980RgtlUaNmEH1U05Rmu_z9NaI0idxfHJRD4LdL7lfDTB3qJVj-d6X7ddVHyQ3ElqlMRSUg6hqyg0MRGbP6yxtIBVIkA(mp4, (34.59 MB) Download video

In vitro models of the developing brain such as three-dimensional brain organoids offer an unprecedented opportunity to study aspects of human brain development and disease. However, the cells generated within organoids and the extent to which they recapitulate the regional complexity, cellular diversity and circuit functionality of the brain remain undefined. Here we analyse gene expression in over 80,000 individual cells isolated from 31 human brain organoids. We find that organoids can generate a broad diversity of cells, which are related to endogenous classes, including cells from the cerebral cortex and the retina. Organoids could be developed over extended periods (more than 9 months), allowing for the establishment of relatively mature features, including the formation of dendritic spines and spontaneously active neuronal networks. Finally, neuronal activity within organoids could be controlled using light stimulation of photosensitive cells, which may offer a way to probe the functionality of human neuronal circuits using physiological sensory stimuli.

Changes in gamma oscillations (20–50 Hz) have been observed in several neurological disorders. However, the relationship between gamma oscillations and cellular pathologies is unclear. Here we show reduced, behaviourally driven gamma oscillations before the onset of plaque formation or cognitive decline in a mouse model of Alzheimer’s disease. Optogenetically driving fast-spiking parvalbumin-positive (FS-PV)-interneurons at gamma (40 Hz), but not other frequencies, reduces levels of amyloid-β (Aβ)1–40 and Aβ 1–42 isoforms. Gene expression profiling revealed induction of genes associated with morphological transformation of microglia, and histological analysis confirmed increased microglia co-localization with Aβ. Subsequently, we designed a non-invasive 40 Hz light-flickering regime that reduced Aβ1–40 and Aβ1–42 levels in the visual cortex of pre-depositing mice and mitigated plaque load in aged, depositing mice. Our findings uncover a previously unappreciated function of gamma rhythms in recruiting both neuronal and glial responses to attenuate Alzheimer’s-disease-associated pathology. Mouse models of Alzheimer’s disease show reduced, behaviourally driven gamma oscillations before the onset of plaque formation or cognitive decline; driving neurons to oscillate at gamma frequency (40 Hz) reduces levels of amyloid-β peptides. Disrupted gamma rhythms—oscillations in the brain's neuronal circuits at around 20–50 Hz—are hallmarks of various neurological disorders and have been seen in patients with Alzheimer's disease and specific mouse models of the disease. Li-Huei Tsai and colleagues show that gamma oscillations are also disrupted in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease, and find reduced gamma prior to plaque formation and cognitive decline. Remarkably, by training neurons to oscillate at gamma frequency (40 Hz) in multiple mouse models including APP/PS1 and wild-type mice, amyloid-β peptide levels could be reduced.

3D functional imaging of neuronal activity in entire organisms at single cell level and physiologically relevant time scales faces major obstacles due to trade-offs between the size of the imaged volumes, and spatial and temporal resolution. Here, using light-field microscopy in combination with 3D deconvolution, we demonstrate intrinsically simultaneous volumetric functional imaging of neuronal population activity at single neuron resolution for an entire organism, the nematode Caenorhabditis elegans. The simplicity of our technique and possibility of the integration into epi-fluoresence microscopes makes it an attractive tool for high-speed volumetric calcium imaging.

A combination of a sensitive blue light–gated channelrhodopsin actuator and red-shifted Arch-based voltage sensors allows all-optical electrophysiology without cross-talk in cultured neurons or brain slices. All-optical electrophysiology—spatially resolved simultaneous optical perturbation and measurement of membrane voltage—would open new vistas in neuroscience research. We evolved two archaerhodopsin-based voltage indicators, QuasAr1 and QuasAr2, which show improved brightness and voltage sensitivity, have microsecond response times and produce no photocurrent. We engineered a channelrhodopsin actuator, CheRiff, which shows high light sensitivity and rapid kinetics and is spectrally orthogonal to the QuasArs. A coexpression vector, Optopatch, enabled cross-talk–free genetically targeted all-optical electrophysiology. In cultured rat neurons, we combined Optopatch with patterned optical excitation to probe back-propagating action potentials (APs) in dendritic spines, synaptic transmission, subcellular microsecond-timescale details of AP propagation, and simultaneous firing of many neurons in a network. Optopatch measurements revealed homeostatic tuning of intrinsic excitability in human stem cell–derived neurons. In rat brain slices, Optopatch induced and reported APs and subthreshold events with high signal-to-noise ratios. The Optopatch platform enables high-throughput, spatially resolved electrophysiology without the use of conventional electrodes.