We present video-rate (28 frames per second) far-field optical imaging with a focal spot size of 62 nanometers in living cells. Fluorescently labeled synaptic vesicles inside the axons of cultured neurons were recorded with stimulated emission depletion (STED) microscopy in a 2.5-micrometer by 1.8-micrometer field of view. By reducing the cross-sectional area of the focal spot by about a factor of 18 below the diffraction limit (260 nanometers), STED allowed us to map and describe the vesicle mobility within the highly confined space of synaptic boutons. Although restricted within boutons, the vesicle movement was substantially faster in nonbouton areas, consistent with the observation that a sizable vesicle pool continuously transits through the axons. Our study demonstrates the emerging ability of optical microscopy to investigate intracellular physiological processes on the nanoscale in real time.

High-definition view of the synapse Individual neurons communicate with one another via their synapses, so to understand the nervous system, we need to understand in detail how the synapses are organized. Wilhelm et al. present a quantitative molecular-scale image of the “average” synapse populated with realistic renditions of each of the protein components that contribute to the inner workings of neurons. Science , this issue p. 1023

We demonstrate far-field fluorescence microscopy with a focal-plane resolution of 15–20 nm in biological samples. The 10- to 12-fold multilateral increase in resolution below the diffraction barrier has been enabled by the elimination of molecular triplet state excitation as a major source of photobleaching of a number of dyes in stimulated emission depletion microscopy. Allowing for relaxation of the triplet state between subsequent excitation–depletion cycles yields an up to 30-fold increase in total fluorescence signal as compared with reported stimulated emission depletion illumination schemes. Moreover, it enables the reduction of the effective focal spot area by up to ≈140-fold below that given by diffraction. Triplet-state relaxation can be realized either by reducing the repetition rate of pulsed lasers or by increasing the scanning speed such that the build-up of the triplet state is effectively prevented. This resolution in immunofluorescence imaging is evidenced by revealing nanoscale protein patterns on endosomes, the punctuated structures of intermediate filaments in neurons, and nuclear protein speckles in mammalian cells with conventional optics. The reported performance of diffraction-unlimited fluorescence microscopy opens up a pathway for addressing fundamental problems in the life sciences.

Diffraction-unlimited imaging is one of the emerging fields in microscopy. In all of these techniques, fluorophore switching is key. The first technique developed is STED, which recently has progressed to video-rate imaging of living cells.

The turnover of brain proteins is critical for organism survival, and its perturbations are linked to pathology. Nevertheless, protein lifetimes have been difficult to obtain in vivo. They are readily measured in vitro by feeding cells with isotopically labeled amino acids, followed by mass spectrometry analyses. In vivo proteins are generated from at least two sources: labeled amino acids from the diet, and non-labeled amino acids from the degradation of pre-existing proteins. This renders measurements difficult. Here we solved this problem rigorously with a workflow that combines mouse in vivo isotopic labeling, mass spectrometry, and mathematical modeling. We also established several independent approaches to test and validate the results. This enabled us to measure the accurate lifetimes of ~3500 brain proteins. The high precision of our data provided a large set of biologically significant observations, including pathway-, organelle-, organ-, or cell-specific effects, along with a comprehensive catalog of extremely long-lived proteins (ELLPs).

Resource16 November 2017Open Access Source DataTransparent process Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy Katharina N Richter Katharina N Richter Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Natalia H Revelo Natalia H Revelo orcid.org/0000-0003-2492-1317 Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Katharina J Seitz Katharina J Seitz Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Martin S Helm Martin S Helm Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Deblina Sarkar Deblina Sarkar MIT Media Lab Search for more papers by this author Rebecca S Saleeb Rebecca S Saleeb Edinburgh Super-Resolution Imaging Consortium, Institute of Biological Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Elisa D'Este Elisa D'Este Department of NanoBiophotonics, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Jessica Eberle Jessica Eberle Department of Neural Systems, Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Eva Wagner Eva Wagner Heart Research Center Göttingen, Department of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany German Center for Cardiovascular Research (DZHK) Site Göttingen Search for more papers by this author Christian Vogl Christian Vogl orcid.org/0000-0003-4432-2733 Institute for Auditory Neuroscience and InnerEarLab, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Auditory Neuroscience Group, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Diana F Lazaro Diana F Lazaro Department of Experimental Neurodegeneration, Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Frank Richter Frank Richter International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Department of Cellular Biochemistry, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Javier Coy-Vergara Javier Coy-Vergara Department of Molecular Biology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Giovanna Coceano Giovanna Coceano Department of Applied Physics and Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Edward S Boyden Edward S Boyden Departments of Brain and Cognitive Science and Biological Engineering, MIT Media Lab and McGovern Institute, Cambridge, MA, USA Search for more papers by this author Rory R Duncan Rory R Duncan Edinburgh Super-Resolution Imaging Consortium, Institute of Biological Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Stefan W Hell Stefan W Hell Department of NanoBiophotonics, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Marcel A Lauterbach Marcel A Lauterbach Department of Neural Systems, Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Stephan E Lehnart Stephan E Lehnart Heart Research Center Göttingen, Department of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany German Center for Cardiovascular Research (DZHK) Site Göttingen Search for more papers by this author Tobias Moser Tobias Moser orcid.org/0000-0001-7145-0533 Institute for Auditory Neuroscience and InnerEarLab, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Auditory Neuroscience Group, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Tiago F Outeiro Tiago F Outeiro orcid.org/0000-0003-1679-1727 Department of Experimental Neurodegeneration, Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Peter Rehling Peter Rehling Department of Cellular Biochemistry, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Blanche Schwappach Blanche Schwappach Department of Molecular Biology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Ilaria Testa Ilaria Testa Department of Applied Physics and Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Bolek Zapiec Bolek Zapiec Max Planck Research Unit for Neurogenetics, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Silvio O Rizzoli Corresponding Author Silvio O Rizzoli [email protected] orcid.org/0000-0002-1667-7839 Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Katharina N Richter Katharina N Richter Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Natalia H Revelo Natalia H Revelo orcid.org/0000-0003-2492-1317 Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Katharina J Seitz Katharina J Seitz Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Martin S Helm Martin S Helm Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Deblina Sarkar Deblina Sarkar MIT Media Lab Search for more papers by this author Rebecca S Saleeb Rebecca S Saleeb Edinburgh Super-Resolution Imaging Consortium, Institute of Biological Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Elisa D'Este Elisa D'Este Department of NanoBiophotonics, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Jessica Eberle Jessica Eberle Department of Neural Systems, Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Eva Wagner Eva Wagner Heart Research Center Göttingen, Department of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany German Center for Cardiovascular Research (DZHK) Site Göttingen Search for more papers by this author Christian Vogl Christian Vogl orcid.org/0000-0003-4432-2733 Institute for Auditory Neuroscience and InnerEarLab, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Auditory Neuroscience Group, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Diana F Lazaro Diana F Lazaro Department of Experimental Neurodegeneration, Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Frank Richter Frank Richter International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany Department of Cellular Biochemistry, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Javier Coy-Vergara Javier Coy-Vergara Department of Molecular Biology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Giovanna Coceano Giovanna Coceano Department of Applied Physics and Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Edward S Boyden Edward S Boyden Departments of Brain and Cognitive Science and Biological Engineering, MIT Media Lab and McGovern Institute, Cambridge, MA, USA Search for more papers by this author Rory R Duncan Rory R Duncan Edinburgh Super-Resolution Imaging Consortium, Institute of Biological Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Stefan W Hell Stefan W Hell Department of NanoBiophotonics, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Marcel A Lauterbach Marcel A Lauterbach Department of Neural Systems, Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Stephan E Lehnart Stephan E Lehnart Heart Research Center Göttingen, Department of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany German Center for Cardiovascular Research (DZHK) Site Göttingen Search for more papers by this author Tobias Moser Tobias Moser orcid.org/0000-0001-7145-0533 Institute for Auditory Neuroscience and InnerEarLab, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Auditory Neuroscience Group, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Tiago F Outeiro Tiago F Outeiro orcid.org/0000-0003-1679-1727 Department of Experimental Neurodegeneration, Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Peter Rehling Peter Rehling Department of Cellular Biochemistry, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Blanche Schwappach Blanche Schwappach Department of Molecular Biology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Ilaria Testa Ilaria Testa Department of Applied Physics and Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Bolek Zapiec Bolek Zapiec Max Planck Research Unit for Neurogenetics, Frankfurt am Main, Germany Search for more papers by this author Silvio O Rizzoli Corresponding Author Silvio O Rizzoli [email protected] orcid.org/0000-0002-1667-7839 Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Author Information Katharina N Richter1,2,‡, Natalia H Revelo1,20,‡, Katharina J Seitz1,3, Martin S Helm1,3, Deblina Sarkar4, Rebecca S Saleeb5, Elisa D'Este6, Jessica Eberle7, Eva Wagner8,9, Christian Vogl10,11, Diana F Lazaro12,13, Frank Richter3,14, Javier Coy-Vergara15, Giovanna Coceano16, Edward S Boyden17, Rory R Duncan5, Stefan W Hell6, Marcel A Lauterbach7, Stephan E Lehnart8,9, Tobias Moser10,11, Tiago F Outeiro12,13, Peter Rehling14,18, Blanche Schwappach15, Ilaria Testa16, Bolek Zapiec19 and Silvio O Rizzoli *,1,2 1Department of Neuro- and Sensory Physiology, University of Göttingen Medical Center, Göttingen, Germany 2Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Göttingen, Germany 3International Max Planck Research School Molecular Biology, Göttingen, Germany 4MIT Media Lab 5Edinburgh Super-Resolution Imaging Consortium, Institute of Biological Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University, Edinburgh, UK 6Department of NanoBiophotonics, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany 7Department of Neural Systems, Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany 8Heart Research Center Göttingen, Department of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 9German Center for Cardiovascular Research (DZHK) Site Göttingen 10Institute for Auditory Neuroscience and InnerEarLab, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 11Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Auditory Neuroscience Group, Göttingen, Germany 12Department of Experimental Neurodegeneration, Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 13Max-Planck-Institute for Experimental Medicine, Göttingen, Germany 14Department of Cellular Biochemistry, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 15Department of Molecular Biology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 16Department of Applied Physics and Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden 17Departments of Brain and Cognitive Science and Biological Engineering, MIT Media Lab and McGovern Institute, Cambridge, MA, USA 18Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany 19Max Planck Research Unit for Neurogenetics, Frankfurt am Main, Germany 20Present address: Department of Tumor Immunology, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, Nijmegen, the Netherlands ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Tel: +49 551 395911; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2018)37:139-159https://doi.org/10.15252/embj.201695709 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Paraformaldehyde (PFA) is the most commonly used fixative for immunostaining of cells, but has been associated with various problems, ranging from loss of antigenicity to changes in morphology during fixation. We show here that the small dialdehyde glyoxal can successfully replace PFA. Despite being less toxic than PFA, and, as most aldehydes, likely usable as a fixative, glyoxal has not yet been systematically tried in modern fluorescence microscopy. Here, we tested and optimized glyoxal fixation and surprisingly found it to be more efficient than PFA-based protocols. Glyoxal acted faster than PFA, cross-linked proteins more effectively, and improved the preservation of cellular morphology. We validated glyoxal fixation in multiple laboratories against different PFA-based protocols and confirmed that it enabled better immunostainings for a majority of the targets. Our data therefore support that glyoxal can be a valuable alternative to PFA for immunostaining. Synopsis Enhanced fixation speed, decreased toxicity and better preservation of cytosolic nanostructures and membrane-bound antigens make the small dialdehyde glyoxal a promising alternative to the commonly used paraformaldehyde (PFA), in particular for super-resolution microscopy. Glyoxal penetrates cells faster than conventional solutions of PFA. Glyoxal fixes and retains more cellular proteins and RNA than PFA. Immunostaining of glyoxal-fixed samples reveals higher amounts of target proteins, and typically results in brighter microscopy images. Glyoxal fixation was validated against multiple PFA-based protocols in several laboratories. Introduction The 4% paraformaldehyde (PFA) solution has been a standard fixative for immunostaining and fluorescence microscopy, for several decades. Nevertheless, the literature contains numerous reports that PFA causes morphological changes, loss of epitopes, or mislocalization of target proteins and that it fixes the samples slowly and incompletely (see, e.g., Melan, 1994; Tanaka et al, 2010; Schnell et al, 2012). Many other fixatives have been introduced to alleviate these problems. Among them, glutaraldehyde is probably the most commonly used, since it fixes the samples faster and more completely than PFA (Smith & Reese, 1980). Mixtures of PFA and glutaraldehyde result in accurate fixation and reduce the lateral mobility of molecules (Tanaka et al, 2010), presumably by increasing the level of protein cross-linking. However, this fixative mixture also reduces the efficiency of immunostainings, by blocking the antibody access to epitopes, or by causing particular epitopes to unfold (Farr & Nakane, 1981). Alcohol-based fixation, such as treatments with ice-cold methanol (Tanaka et al, 2010), results in stable fixation for a sub-population of cellular structures (such as microtubules), but leads to poor morphology preservation and to a loss of membranes and cytosolic proteins. Overall, the improvements in fixation induced by glutaraldehyde or methanol do not compensate for their shortcomings, thus in most cases leaving PFA as the current fixative of choice. A superior alternative to PFA is needed, especially since artifacts that were negligible in conventional microscopy are now rendered visible by the recent progress in super-resolution microscopy (nanoscopy; Eggeling et al, 2015). To find a fixative that maintains high-quality immunostainings while alleviating PFA problems, we have tested several compounds. We searched for commercially available molecules, which could be readily used by the imaging community. These included different combinations of PFA and glutaraldehyde, picric acid (Hopwood, 1985), and di-imido-esters (Woodruff & Rasmussen, 1979), which, however, were not better than PFA in immunostaining experiments. We have also investigated different aldehydes. We avoided highly toxic compounds such as acrolein, which would not be easy to use in biology laboratories, and we also avoided large aldehydes (more than 4–5 carbon atoms), whose fixative properties are expected to mimic those of glutaraldehyde. The small dialdehyde glyoxal fits these two criteria, since it has a low toxicity (as already noted in the 1940s, Wicks & Suntzeff, 1943) and contains only two carbon atoms. Glyoxal is used, at low concentrations, in glycation and metabolism studies (Boucher et al, 2015), which ensures that it is commercially available. It can be used as a fixative and has even been once described, in 1963, to provide better morphology preservation to formaldehyde (Sabatini et al, 1963). It is almost unknown in fluorescence experiments. We were able to find one publication, from 1975 (Swaab et al, 1975), in which glyoxal was used in immunofluorescence on brain samples, albeit followed by sample freezing, and by procedures that are not compatible with modern, high-quality microscopy. We could also find a few publications on histological stains using glyoxal (e.g., Umlas & Tulecke, 2004; Paavilainen et al, 2010), which further encouraged us to test this compound. We tested glyoxal thoroughly, in preparations ranging from cell-free cytosol to tissues, and by methods spanning from SDS–PAGE to electron microscopy and super-resolution fluorescence microscopy. We found that glyoxal penetrated cells far more rapidly than PFA and cross-linked proteins and nucleic acids more strongly, leading to a more accurate preservation of cellular morphology. Despite the stronger fixation, glyoxal did not cause a reduction of antibody binding to the samples. On the contrary, the resulting images were typically brighter than those obtained after PFA fixation. The initial optimization work was performed in one laboratory (Rizzoli, University Medical Center Göttingen, Germany), and the results were independently tested in 11 additional laboratories/teams: Boyden (MIT Media Lab and McGovern Institute, Massachusetts, USA), Duncan (Heriot-Watt University, Edinburgh, UK), Hell (Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), Lauterbach (Max-Planck-Institute for Brain Research, Frankfurt am Main, Germany), Lehnart (University Medical Center Göttingen, Germany), Moser (University Medical Center Göttingen, Germany), Outeiro (University Medical Center Göttingen, Germany), Rehling (University Medical Center Göttingen, Germany), Schwappach (University Medical Center Göttingen, Germany), Testa (KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden), and Zapiec (Max Planck Research Unit for Neurogenetics, Frankfurt am Main, Germany). We conclude that the immunostainings performed after glyoxal fixation were superior for the majority of the samples and targets, with only a minority (~10%) of the targets being less well preserved and/or revealed. Results Glyoxal preserves the cellular morphology more accurately than PFA and fixes proteins and RNAs more strongly To determine the optimal conditions of glyoxal fixation, we tested its action at different pH values (Appendix Table S1). We found that glyoxal requires an acidic pH, roughly between 4 and 5, despite one previous study that suggests that it may also fix samples at a neutral pH (Sabatini et al, 1963). In addition, we found that the morphology of the samples was much improved upon addition of a low-to-medium concentration of alcohol (ethanol, 10–20%), which may act as an accelerator in the fixation reactions. Removing the ethanol, or adjusting the pH above or below the 4–5 range, resulted in poor sample morphology (Appendix Table S1). pH values of 4 or 5 provided similar results for most of our experiments (results obtained at pH 5 are shown in all figures, unless noted otherwise) and provided better morphology preservation for cultured neurons than PFA. We tested PFA at various pH values (4, 5, and 7), with or without ethanol, at room temperature or at 37°C (Appendix Table S1), without finding a condition where the morphology of the PFA-fixed samples consistently bettered that of glyoxal-fixed samples. We then proceeded to compare PFA and glyoxal fixation quantitatively. We first tested the speed with which these fixative solutions penetrate the cell membrane, by monitoring the fluorescence of propidium iodide, a fluorogenic probe that binds nucleic acids, and cannot enter living cells (Davey & Kell, 1996). Paraformaldehyde fixation allowed propidium iodide entry into cultured cells only after ~40 min, while glyoxal was substantially faster (Fig 1A). The same was observed using the membrane-impermeant styryl dye FM 1-43 (Betz et al, 1992): Glyoxal fixation enabled significant FM 1-43 penetration within 1–2 min (Fig 1B). The difference in membrane penetration is probably due to the ethanol present in the glyoxal fixative, since the addition of ethanol to the PFA solution enhances its penetration into cells in a similar fashion (Appendix Fig S1), albeit it did not improve immunostainings with PFA (Appendix Fig S1; we would like to point out that low pH values, 4 and 5, also failed to improve PFA immunostainings, as shown in the same Appendix figure). In the same experiments, FM 1-43 addition enabled us to visualize endocytotic events that took place during PFA fixation. Such events could be observed in every fixed cell (Fig 1B) and indicated that the cells were still active during PFA fixation, from the point of view of membrane trafficking. No such events could be detected during glyoxal fixation. Figure 1. Comparison of cell penetration by PFA and glyoxal Speed of propidium iodide (PI) penetration into fibroblasts during 60 min of fixation with either 4% PFA or 3% glyoxal. N = 3 independent experiments. Glyoxal fixation enables PI to penetrate far more rapidly into the cells. Speed of FM 1-43 penetration in similar experiments. The arrowhead points to one example of ongoing endocytosis during PFA fixation. N = 3–4 independent experiments. The general pattern of FM 1-43 entry was similar to that of propidium iodide. Only the first 10 min are shown, to enable an optimal observation of the kinetics of the first stages of FM 1-43 entry. The results parallel those obtained with PI: faster penetration during glyoxal fixation. Data information: Scale bar = 40 μm; **P < 0.01 (two-sided Student's t-test). Download figure Download PowerPoint The hypothesis that cells were still partially active during PFA fixation, and less so in glyoxal fixation, was also confirmed by other experiments. First, we tested whether transferrin, which is readily endocytosed by a clathrin-mediated pathway, through the involvement of the transferrin receptor, is internalized during fixation. We applied fluorescently conjugated transferrin onto cells during fixation with glyoxal or PFA (Appendix Fig S2). We found that it was mainly fixed onto the plasma membrane by glyoxal, but that it was present both in the cells and on the membrane during PFA fixation (Appendix Fig S2). Second, we tested whether the acidic lumen of the lysosome was maintained after fixation, by applying the probe LysoTracker (Appendix Fig S3). Substantial LysoTracker labeling was observed after PFA fixation, but not after glyoxal fixation. Both of these experiments, therefore, indicate that glyoxal fixation stops cellular functions more efficiently than PFA. The higher speed of membrane penetration seen with glyoxal was coupled to a better preservation of the general cell morphology, as observed by imaging cells during fixation (Fig 2). Paraformaldehyde fixation was associated with the formation of membrane blebs and vacuoles, with organelle movement, and with a general change in the cell morphology (Fig 2). Glyoxal fixation appeared to modify the cell morphology far less. This impression was confirmed by calculating the correlation coefficient between the initial cell images and images acquired at 5-min intervals during fixation (Fig 2). To obtain a similar view at the level of single organelles, we imaged the movement of endosomes labeled with fluorescently conjugated transferrin or cholera toxin. As for the general cell morphology, glyoxal reduced the organelle movement more than PFA (Appendix Fig S4). Figure 2. A comparison of morphological changes taking place during fixation with PFA or glyoxalThe changes were visualized by DIC images taken at 5-min intervals during fixation. The graph shows the correlation of each image to the first frame. N = 50 (PFA) and 54 (glyoxal) cellular regions analyzed, from three independent experiments (mean ± SEM). The higher correlation value indicates that glyoxal preserves the initial cell morphology with higher accuracy than PFA. Scale bar = 20 μm; **P < 0.01 (two-sided Student's t-test). Download figure Download PowerPoint We also monitored the morphology of mitochondria, which are known to become fragile during fixation. We visualized mitochondria in living cells, by tagging them with a GFP-linked reporter (TOMM70, Appendix Fig S5), and imaged them again after fixation. Glyoxal preserved mitochondria at least as well as PFA. Moreover, ethanol addition to the PFA solutions worsened the preservation of mitochondria morphology, which suggests that ethanol does not improve PFA fixation, although it enhances its membrane penetration (Appendix Fig S5). To test this issue further, we analyzed the correlation between the pre- and post-fixation images for fluorescent protein chimeras of a mitochondria reporter (TOMM70), a Golgi apparatus reporter (GalNacT2), a plasma membrane reporter (SNAP25), a cytoskeleton reporter (tubulin), and a vesicular reporter (synaptophysin). The correlations were similar among the two fixatives for TOMM70, GalNacT2, tubulin, and SNAP25. However, the pre- and post-fixation correlations in glyoxal fixed samples were higher for synaptophysin (Appendix Fig S6), which marks the most mobile elements we investigated in this experiment (vesicles). We then tested the protein cross-linking capacity of the different fixatives, by monitoring the proportion of the proteins that remained unfixed. We incubated brain cytosol samples with different fixatives for 60 min and followed this by running the samples on polyacrylamide gels (Fig 3A, Appendix Fig S7). Paraformaldehyde, with or without ethanol addition, left ~40% of the proteins unaffected (unfixed). Glyoxal (both pH 4 and 5) reduced this unfixed pool to ~20%. Shorter fixation times reduced the amount of fixed proteins for all fixation conditions (Appendix Fig S7). Glyoxal, both at pH 4 or at pH 5, fixed more proteins than PFA, PFA and ethanol or PFA at low pH, at all time points (Appendix Fig S7). Figure 3. Comparison of protein and RNA fixation by PFA and glyoxal SDS–PAGE gel showing rat bra

Aggregation of alpha-synuclein (ASYN) in Lewy bodies and Lewy neurites is the typical pathological hallmark of Parkinson's disease (PD) and other synucleinopathies. Furthermore, mutations in the gene encoding for ASYN are associated with familial and sporadic forms of PD, suggesting this protein plays a central role in the disease. However, the precise contribution of ASYN to neuronal dysfunction and death is unclear. There is intense debate about the nature of the toxic species of ASYN and little is known about the molecular determinants of oligomerization and aggregation of ASYN in the cell. In order to clarify the effects of different mutations on the propensity of ASYN to oligomerize and aggregate, we assembled a panel of 19 ASYN variants and compared their behaviour. We found that familial mutants linked to PD (A30P, E46K, H50Q, G51D and A53T) exhibited identical propensities to oligomerize in living cells, but had distinct abilities to form inclusions. While the A30P mutant reduced the percentage of cells with inclusions, the E46K mutant had the opposite effect. Interestingly, artificial proline mutants designed to interfere with the helical structure of the N-terminal domain, showed increased propensity to form oligomeric species rather than inclusions. Moreover, lysine substitution mutants increased oligomerization and altered the pattern of aggregation. Altogether, our data shed light into the molecular effects of ASYN mutations in a cellular context, and established a common ground for the study of genetic and pharmacological modulators of the aggregation process, opening new perspectives for therapeutic intervention in PD and other synucleinopathies.

Scientific Report10 July 2018Open Access Transparent process X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes Sven Truckenbrodt Corresponding Author Sven Truckenbrodt [email protected] Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany International Max Planck Research School for Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Manuel Maidorn Manuel Maidorn Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany International Max Planck Research School for Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Dagmar Crzan Dagmar Crzan Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Hanna Wildhagen Hanna Wildhagen Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Selda Kabatas Selda Kabatas Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Silvio O Rizzoli Corresponding Author Silvio O Rizzoli [email protected] orcid.org/0000-0002-1667-7839 Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Sven Truckenbrodt Corresponding Author Sven Truckenbrodt [email protected] Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany International Max Planck Research School for Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Manuel Maidorn Manuel Maidorn Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany International Max Planck Research School for Molecular Biology, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Dagmar Crzan Dagmar Crzan Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Hanna Wildhagen Hanna Wildhagen Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Selda Kabatas Selda Kabatas Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Silvio O Rizzoli Corresponding Author Silvio O Rizzoli [email protected] orcid.org/0000-0002-1667-7839 Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany Search for more papers by this author Author Information Sven Truckenbrodt *,1,2,3, Manuel Maidorn1,2, Dagmar Crzan1, Hanna Wildhagen1, Selda Kabatas1 and Silvio O Rizzoli *,1 1Institute for Neuro- and Sensory Physiology, Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration, Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany 2International Max Planck Research School for Molecular Biology, Göttingen, Germany 3Present address: Institute for Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Austria *Corresponding author. Tel: +43 2243 9000 2063; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +49 551 39 5911; E-mail: [email protected] EMBO Reports (2018)19:e45836https://doi.org/10.15252/embr.201845836 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Expansion microscopy is a recently introduced imaging technique that achieves super-resolution through physically expanding the specimen by ~4×, after embedding into a swellable gel. The resolution attained is, correspondingly, approximately fourfold better than the diffraction limit, or ~70 nm. This is a major improvement over conventional microscopy, but still lags behind modern STED or STORM setups, whose resolution can reach 20–30 nm. We addressed this issue here by introducing an improved gel recipe that enables an expansion factor of ~10× in each dimension, which corresponds to an expansion of the sample volume by more than 1,000-fold. Our protocol, which we termed X10 microscopy, achieves a resolution of 25–30 nm on conventional epifluorescence microscopes. X10 provides multi-color images similar or even superior to those produced with more challenging methods, such as STED, STORM, and iterative expansion microscopy (iExM). X10 is therefore the cheapest and easiest option for high-quality super-resolution imaging currently available. X10 should be usable in any laboratory, irrespective of the machinery owned or of the technical knowledge. Synopsis The X10 expansion microscopy protocol presented here enables 25-nm resolution on conventional microscopes, for at least three imaging channels, in a simple one-step expansion protocol. X10 achieves one-step 10-fold expansion of biological samples. X10 enables 25-nm resolution on conventional microscopes. X10 allows multi-color super-resolution imaging for at least three parallel imaging channels. Introduction The resolution of fluorescence microscopes has been limited by the diffraction barrier to approximately half of the wavelength of the imaging light (in practice, 200–350 nm). This barrier has been lifted by several microscopy concepts, for example, by using patterned light beams to determine the coordinates from which fluorophores are permitted to emit, as in the stimulated emission depletion (STED) family 1, 2, or by determining the positions of single fluorophores that emit randomly, as in photo-activated localization microscopy (PALM) 3, stochastic optical reconstruction microscopy (STORM and dSTORM) 4, 5, or ground state depletion microscopy followed by individual molecule return (GSDIM) 6 Although such technologies have been applied to biology for more than a decade, their general impact on biomedical research is still relatively limited. This is mainly due to the fact that accurate super-resolution is still available only for selected laboratories that are familiar with the different tools, are able to apply the appropriate analysis routines, and/or possess the often highly expensive machinery required. The ideal super-resolution tool for the general biologist needs to be easy to implement, without specialized equipment and without the need for complex imaging analysis. At the same time, such a technique would need to be highly reliable and should be easy to apply to multiple color channels simultaneously. The expected resolution should be at least on the size scale of the labeling probes used. This would be ~20–30 nm for normal immunostaining experiments, since these rely on identifying the epitopes via primary antibodies that are later detected through secondary antibodies, each of which is ~10–15 nm in size. Expansion microscopy, a technique introduced by the Boyden laboratory 7-10, is an important step in this direction. Expansion microscopy entails that the sample of interest is first fixed, permeabilized, and immunostained and is then embedded in polyelectrolyte gels, which expand strongly when dialyzed in water. To ensure that no disruption of the sample aspect ratio occurs, the sample is digested using proteases after embedding, but before the expansion step. The fluorophores, which are covalently bound to the gel, thus maintain their relative positions, although they are now positioned a few-fold farther away from each other than in the initial sample. The preparation can then be imaged in a conventional microscope. This renders expansion microscopy the simplest approach, to date, that is able to produce super-resolution images. However, the initial implementations of this approach were performed with gels that expanded, on average, about fourfold, which resulted in lateral resolutions of ~70 nm, i.e. not as high as that of modern STED or STORM microscopes 7. The only solution proposed so far to this problem has been to use complex procedures consisting of multiple successive expansion steps (iterative expansion), which would require the embedding, expansion, re-embedding, and re-expansion of the sample. We set out here to solve this problem, by generating a protocol that uses only one embedding and expansion step, but still obtains a resolution of the required value (20–30 nm), in multiple color channels, without any difficult techniques, tools, or analysis routines. Our protocol expands the sample by 10-fold, and we therefore termed it X10 microscopy. It achieves a resolution of 25–30 nm on conventional epifluorescence microscopes and does not even require confocal imaging for accurate nanoscale analyses. We compared X10 microscopy with state-of-the-art commercial implementations of both STED and STORM, and found it to be superior to both. Judging from the available literature, it is clear that self-built super-resolution microscopes, operated and optimized by specialists, could provide images that are superior to our X10 implementations on epifluorescence setups. In spite of this, the fact that X10 is the simplest and cheapest super-resolution technique currently available, with a resolution performance that is superior to what is available to the general biologist (i.e. the commercial implementations of these techniques), should render it the tool of choice for the implementation of super-resolution in the general biology laboratory. Results and Discussion To obtain a resolution of 20–30 nm within a one-step expansion procedure, we generated a protocol that enables the use of a superabsorbent hydrogel designed for excellent mechanical sturdiness 11 for the expansion of biological samples. This gel uses N,N-dimethylacrylamide acid (DMAA) for generating polymer chains, which are crosslinked with sodium acrylate (SA) to produce a swellable gel matrix (Fig 1). The gelation–free radical polymerization reaction is catalyzed by potassium persulfate (KPS) and N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine (TEMED; Fig 1A), and produces a gel that can expand > 10× in each dimension when placed in distilled water (Fig 1B and C). Protein retention in the gel is achieved via the previously described anchoring approach 8, 9, by employing Acryloyl-X. This uses NHS ester chemistry to covalently attach to proteins, while a second reactive acrylamide group integrates into the polymerizing gel matrix. Figure 1. X10 gel polymerization reactions Primary TEMED, sulfate, and hydroxyl radicals are generated by redox initiation with KPS and TEMED 37. Radical propagation occurs when the monomer (DMAA) 11, 38, ionic co-monomer (SA) 11, and tissue-anchored acryloyl monomer react with the primary radicals. Besides linear growth of the resulting polymer, DMAA also cross-links after proton abstraction at the methylene group 11, 38. The radical chain grows by reacting with monomers and through radical transfer to monomers or other polymers to form a branched network. Critical steps are shown in red. Download figure Download PowerPoint The different steps of the gel formation and protein retention reactions were initially difficult to optimize and therefore required extensive testing and fine-tuning. Nevertheless, the final version of the protocol is trivially simple and is highly reproducible. We present the critical steps in red in Fig 1, and we have included a complete protocol in Materials and Methods. Briefly, the main issues are the following. First, the reactions are extremely fast, and therefore, low temperature and high speed of application are essential, unlike in the gels used for 4× expansion. Second, oxygen inhibits polymerization and therefore needs to be carefully eliminated by bubbling with N2. This is a trivial procedure, which requires no specialized setup (other than a tube to conduct the N2 gas from a pressured gas container into the reaction mixture). Third, the gelation is initially rapid (it only takes minutes for the initial hardening), but does not continue with the same speed, and therefore, care must be taken that the gel is allowed to polymerize for 6–24 h. Should these steps be followed as described here, and the resulting gel formation is highly reproducible (Figs 2 and EV1). The maximum expansion factor we achieved with this approach was ~11.5× (Fig 2A and C; see also Materials and Methods), which results in images with an apparent lateral resolution of ~25–30 nm (predicted from Abbe's resolution limit; Figs 2A–C and 3), in which substantially more details are revealed (Fig 2A–C and Movie EV1). Figure 2. X10 achieves super-resolution of biological samples on conventional epifluorescence microscopes The X10 gel is swellable to > 10× of its original size. The top panel on the left shows an overview image of COS7 cells stained for tubulin, before expansion. The bottom panel shows the cells framed in the top panel (white rectangle), after expansion. The images are to scale, demonstrating an expansion factor of 11.4× in this example. Scale bars: 100 μm (both panels). The post-expansion image is dimmer, as the fluorophores are diluted ˜1,000-fold and therefore requires a longer acquisition time and a higher camera gain. The right panels reveal the 3D organization of the tubulin network in COS7 cells. The relative axial position of the fluorophores is visualized in a z-stack projection by color-coding (see scale at the bottom). Orthogonal views are given next to the z-stack projection (yz view across the midline, xz view along the bottom). A movie through this z-stack, including a rocking projection, is available in Movie EV1. Expansion factor: 11.4×. Scale bar: 1 μm. Comparison between pre-expansion resolution of tubulin imaging in COS7 cells (upper panel) and post-expansion resolution in the same sample (lower panel). Note that the images have not been processed to minimize distortions or to achieve a better correlation. Expansion factor: 11.5×. Scale bar: 1 μm. An exemplary measurement for the X10 expansion factor. A line scan was drawn over corresponding regions before and after expansion, as indicated in panel (B) by the colored lines. An analysis of the root mean square error (RMSE) of the distortions between aligned pre- and post-expansion images (see Materials and Methods for details; n = 34 automated measurements from four independent experiments). Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV1. Insufficient anchoring, gel polymerization, or digestion can affect the sample integrity An intact sample of COS7 cell stained for tubulin, after expansion. Cell integrity is maintained, and no breaks or tears are evident. Anchoring, gel polymerization, and digestion were carried out as described in Materials and Methods. Expansion factor: 11.4×. Scale bar: 100 μm. A damaged sample of COS7 cells stained for tubulin, after expansion. Multiple tears and distortions are evident. This occurs when protein retention, anchoring, and gel polymerization are incomplete, i.e., because of insufficient polymerization time, or when digestion is incomplete, i.e., through digestion at room temperature instead of at 50°C. Expansion factor: 9.4×. Data information: Note that both images are stitched together from multiple imaging frames. Download figure Download PowerPoint Figure 3. The resolution of X10 is ~25 nm Immunostainings for the peroxisome membrane protein Pmp70 in neurons are shown. The first five panels show individual peroxisomes imaged with a confocal microscope before expansion, with a STED microscope before expansion, with a STORM microscope before expansion, with an epifluorescence microscope after classical 4× expansion microscopy, and with an epifluorescence microscope after X10 (without and with deconvolution). Expansion factors: 3.8× for classical 4× expansion microscopy and 9.5× for X10. Scale bar: 100 nm (applies to all panels). The red line in the X10 panel indicates a line scan over the peroxisome membrane (60 nm in length). See Fig EV2 for further examples. The exemplary line scan from the X10 image in (A) is shown with a best Gaussian fit curve, with an indicated measurement of resolution as the full width at half maximum (FWHM). A quantification of the average resolution, which is 25.2 ± 0.2 nm (n = 653 line scans across peroxisomes from two independent experiments). The data are represented as a box plot with median (horizontal line) and upper and lower quartile boundaries (box range), plus 1.5 times inter-quartile range (whiskers) and outliers (dots). Download figure Download PowerPoint The resulting technique is fully compatible with the use of common affinity probes, such as antibodies (Fig 2), since X10 requires no specially designed labeling tools, similar to recent improvements to the 4× expansion 8, 9. The distortions of the sample introduced by the gel during swelling are minimal (Fig 2D) and are virtually identical to those seen in 4× expansion microscopy 7, 8, 12. We would like to note, however, that the extensive digestion required for X10 is incompatible with expansion microscopy protocols that preserve fluorescent proteins 9. These protocols utilize a milder digestion that retains some fluorescent proteins. This milder digestion, however, does not allow X10 to retain the sample integrity at higher expansion factors (Fig EV1). Therefore, fluorescent proteins will be visualized in X10 only by immunostaining them. However, this is not a major difficulty, as antibodies are currently available for all major fluorescent proteins. We would also like to note that X10 once more highlights the need for new probes for super-resolution imaging, as conventional antibodies usually do not result in a continuous staining of microtubules, but in a pearls-on-a-string pattern (as visible in Fig 2). This artifact, which is due to incomplete epitope coverage through conventional antibodies 13, 14, can be observed also in many published works using other super-resolution techniques, such as STED 14-18 and STORM 18-22 (see also Appendix Fig S1). Alternatively, highly optimized tubulin labeling protocols should be used to ensure optimal epitope coverage. To verify the resolution of X10 experimentally, we relied on investigating peroxisomes, which are round organelles with dimensions of ~100–200 nm in neurons. We immunostained Pmp70, a protein of the peroxisome membrane (Fig 3), and we compared pre-expansion images with post-expansion images, as well as with STED and STORM images (Fig 3A; see Fig EV2 for a more detailed comparison and Movie EV2 for a z-stack through several peroxisomes). To determine the nominal resolution of X10, we drew line scans through the membranes of the peroxisomes (post-expansion), fitted them to Gaussian curves, and determined their full width at half maximum values (FWHM; Fig 3B). The resolution determined in this fashion fits the theoretical prediction from Abbe's resolution limit that we have stated above, being centered at 25.2 ± 0.2 nm (Fig 3C). Click here to expand this figure. Figure EV2. X10's resolution of ~25 nm is superior to commercial state-of-the-art STED and STORM setups X10 microscopy of neuronal peroxisomes stained for the peroxisome membrane marker Pmp70 (maximum intensity projections from a z-stack). The large panel shows an overview image, while the smaller panels are a gallery of individual peroxisomes. The left bottom panel (simulated) shows a simulated peroxisome, from a model that takes into account antibody size, as well as the random distribution and orientation of primary and secondary antibodies. Expansion factor: 9.4×. Scale bars: 1 μm (large panel), 100 nm (small panels); the scale bars also apply to (B–D). For comparison purposes, a simulated peroxisome with a diameter of 100 nm is shown. STORM of neuronal peroxisomes stained for the peroxisome membrane marker Pmp70. The panels are arranged as in (A), and an average peroxisome (constructed from averaging 37 peroxisomes from our experimental data) is also shown. The lower level of detail that can be reliably observed in the STORM-revealed peroxisomes is due to two effects: First, the blinking behavior of the fluorophores is not perfect, which implies that not all antibodies will be detected, resulting in a spottier pattern than in X10; and second, the entire volume of the peroxisome is within the imaging plane. For X10, the enlargement along the z-axis implies that only ˜2/3 of the peroxisome volume is in focus, which sharpens the detection of the lateral membrane. The STORM images are readily reproduced by simulations of peroxisomes, if we take into account the factors explained above (both a 100-nm peroxisome and a 150-nm peroxisome are simulated). STED microscopy of neuronal peroxisomes stained for the peroxisome membrane marker Pmp70. The panels are arranged as in (A); again, two simulated images are provided, one for a peroxisome with 100 nm diameter and one for a peroxisome with 150 nm diameter. The state-of-the-art commercial STED setup that we used achieved a lateral resolution of ˜38.9 nm here, which is sufficient to detect reliably the lumen of the 150-nm-diameter peroxisomes, but has more difficulties for smaller ones, such as the 100-nm-diameter peroxisome. Classical 4× expansion microscopy of neuronal peroxisomes stained for the peroxisome membrane marker Pmp70 (maximum intensity projections from a z-stack). The panels are arranged as in (A). Expansion factor: 3.8×. As for STED microscopy, the lumen of a 100-nm-diameter peroxisome is virtually impossible to discern (see simulation), but the lumen is visible in larger peroxisomes. Download figure Download PowerPoint We have also simulated peroxisomes stained for Pmp70, taking into account the size and random orientation of the primary/secondary antibody complexes (Fig EV3; see Materials and Methods for details), and found that the measured resolution value fits closely to the one predicted by the simulations (22.8 nm, on 10,000 simulated peroxisomes). This level of resolution is usually only achieved in highly specialized applications of STED and STORM 23, 24 or in iterative expansion microscopy (iExM) 25 and is bettered substantially only by a recently developed tool, MINFLUX microscopy 26. When investigating the same protein in state-of-the-art commercial STED and STORM setups, the image quality these techniques achieved was, at best, comparable to that of X10 (Figs 3A and EV2). We used the modeling approach to determine whether we could, theoretically, resolve the lumen of microtubules, but found that this is beyond the limits of X10, when implemented with epifluorescence microscopy (Appendix Fig S2), due to problems in the placement of antibodies across the expanded microtubule. Their large size effectively limits the level of detail that can be observed 25, 27, which implies that the ~25-nm resolution is possibly the maximum useful resolution that can be achieved in expansion microscopy when using conventional primary/secondary antibody stainings and epifluorescence microscopy. The use of antibodies in X10 can indeed blur the original staining, resulting in a larger perceived object (Appendix Fig S3). Click here to expand this figure. Figure EV3. A model for predicting useful resolution in expansion microscopy The theory of the model. A peroxisome with a diameter of 100 nm is shown in light blue, decorated with primary antibodies (light gray) and secondary antibodies (black with magenta stars to indicate fluorophores), which are placed randomly, and with random orientations. The penetration of the secondary antibody into the peroxisome lumen is allowed, to account for the permeabilization of the peroxisome membrane during immunostaining. The dashed light magenta rings indicate the outer and inner bounds of fluorophore localizations. The dashed dark magenta rings indicate the outer and inner bounds of the diffraction-limited point spread functions resulting from the fluorophores, in conventional epifluorescence microscopy. The point spread function bounds are placed as they would appear after 10× expansion of the structure (the size bars indicated in the figure reflect the original size of the structure, not the size after expansion). It is apparent that X10 should be readily able to resolve the lumen of peroxisomes with a diameter of 100 nm. Histograms showing the resolution, expressed as the full width at half maximum (FWHM), measured on the membrane edges of simulated (top, 10,000 simulated line scans) and experimentally imaged (bottom, 653 line scans) peroxisomes. The model and the experimental data are in good agreement, with the model predicting an average resolution of 22.8 nm and an experimentally determined average resolution of 25.2 nm (see Fig 3). Download figure Download PowerPoint The X10 procedure can be used to achieve multi-color super-resolution imaging. We could easily resolve, for example, synaptic vesicle clusters in cultured hippocampal neurons, along with the pre-synaptic active zones and the post-synaptic densities (Fig 4A–C; Movies EV3 and EV4). This enabled us to measure the distance between the pre-synaptic active zone, identified by Bassoon, and the post-synaptic density, identified by Homer 1 (Fig 4D). We found this distance to be ~120–140 nm, very similar to what has been previously described for these proteins using STORM 24, 28. The overall organization of the Homer 1 and Bassoon immunostainings, in the form of loose clusters containing multiple areas of dense packing, is also very similar to what has been observed with advanced STORM 29. This type of information could not be obtained either with conventional microscopy or with classical 4× expansion microscopy (Appendix Fig S4). At the same time, we also analyzed, in a similar fashion, the pre-synaptic active zone proteins RIM1/2 and the post-synaptic marker PSD95, which should be separated by ~80 nm 24. We found them to be separated by this distance also in X10 experiments (Fig 4E and F). This type of analysis can be performed also in confocal microscopy, but one does not necessarily obtain much information (Fig EV4), as the dim samples obtained by 1,000-fold volume expansion are not ideal for confocal imaging. Figure 4. Multi-color imaging with X10 reveals synaptic ultrastructure in cell culture Three-color imaging resolves synaptic vesicle clusters (identified by Synaptophysin), along with pre-synaptic active zones (identified by Bassoon) and post-synaptic densities (identified by Homer 1). The panel at the top right gives a schematic overview of the organization of a synapse, for orientation (colors as in the fluorescence images). The two panels on the bottom right provide a stereo view of the synapses. Expansion factor: 11.0×. Scale bars: 500 nm (both). Upper panels: higher magnification images show the alignment of pre-synaptic active zones and post-synaptic densities, as well as the distance between them, in side view. Expansion factor: 11.0×. Scale bar: 200 nm. Lower panels: a z-stack through an additional synapse, in face view. Expansion factor: 11.0×. Scale bar: 200 nm. Representative images of an immunostaining for pre-synaptic RIM1/2 and post-synaptic PSD95, two markers known to be more closely associated than Bassoon/Homer 1 24. Arrowheads indicate nanocolumns of aligned pre- and post-synaptic proteins. Expansion factor: 10.4×. Scale bars: 500 nm (upper panel), 200 nm (lower panels). Line scans through Bassoon staining (green) in pre-synaptic active zones and through Homer 1 staining (magenta) in the corresponding post-synaptic densities reveal the distance between the two. The image inset shows three example line scans and identifies them by number. Line scans through RIM1/2 staining (green) in pre-synaptic active zones and through PSD95 staining (magenta) in the corresponding post-synaptic densities reveal the di

NeuroLNC , a previously unknown long ncRNA, regulates neuronal activity by interacting with the neurodegeneration protein TDP-43.