Existing human genome assemblies have almost entirely excluded repetitive sequences within and near centromeres, limiting our understanding of their organization, evolution, and functions, which include facilitating proper chromosome segregation. Now, a complete, telomere-to-telomere human genome assembly (T2T-CHM13) has enabled us to comprehensively characterize pericentromeric and centromeric repeats, which constitute 6.2% of the genome (189.9 megabases). Detailed maps of these regions revealed multimegabase structural rearrangements, including in active centromeric repeat arrays. Analysis of centromere-associated sequences uncovered a strong relationship between the position of the centromere and the evolution of the surrounding DNA through layered repeat expansions. Furthermore, comparisons of chromosome X centromeres across a diverse panel of individuals illuminated high degrees of structural, epigenetic, and sequence variation in these complex and rapidly evolving regions.

Abstract Apes possess two sex chromosomes—the male-specific Y chromosome and the X chromosome, which is present in both males and females. The Y chromosome is crucial for male reproduction, with deletions being linked to infertility 1 . The X chromosome is vital for reproduction and cognition 2 . Variation in mating patterns and brain function among apes suggests corresponding differences in their sex chromosomes. However, owing to their repetitive nature and incomplete reference assemblies, ape sex chromosomes have been challenging to study. Here, using the methodology developed for the telomere-to-telomere (T2T) human genome, we produced gapless assemblies of the X and Y chromosomes for five great apes (bonobo ( Pan paniscus ), chimpanzee ( Pan troglodytes ), western lowland gorilla ( Gorilla gorilla gorilla ), Bornean orangutan ( Pongo pygmaeus ) and Sumatran orangutan ( Pongo abelii )) and a lesser ape (the siamang gibbon ( Symphalangus syndactylus )), and untangled the intricacies of their evolution. Compared with the X chromosomes, the ape Y chromosomes vary greatly in size and have low alignability and high levels of structural rearrangements—owing to the accumulation of lineage-specific ampliconic regions, palindromes, transposable elements and satellites. Many Y chromosome genes expand in multi-copy families and some evolve under purifying selection. Thus, the Y chromosome exhibits dynamic evolution, whereas the X chromosome is more stable. Mapping short-read sequencing data to these assemblies revealed diversity and selection patterns on sex chromosomes of more than 100 individual great apes. These reference assemblies are expected to inform human evolution and conservation genetics of non-human apes, all of which are endangered species.

Abstract Existing human genome assemblies have almost entirely excluded highly repetitive sequences within and near centromeres, limiting our understanding of their sequence, evolution, and essential role in chromosome segregation. Here, we present an extensive study of newly assembled peri/centromeric sequences representing 6.2% (189.9 Mb) of the first complete, telomere-to-telomere human genome assembly (T2T-CHM13). We discovered novel patterns of peri/centromeric repeat organization, variation, and evolution at both large and small length scales. We also found that inner kinetochore proteins tend to overlap the most recently duplicated subregions within centromeres. Finally, we compared chromosome X centromeres across a diverse panel of individuals and uncovered structural, epigenetic, and sequence variation at single-base resolution across these regions. In total, this work provides an unprecedented atlas of human centromeres to guide future studies of their complex and critical functions as well as their unique evolutionary dynamics. One-sentence summary Deep characterization of fully assembled human centromeres reveals their architecture and fine-scale organization, variation, and evolution.

Abstract Human centromeres have been traditionally very difficult to sequence and assemble owing to their repetitive nature and large size 1 . As a result, patterns of human centromeric variation and models for their evolution and function remain incomplete, despite centromeres being among the most rapidly mutating regions 2,3 . Here, using long-read sequencing, we completely sequenced and assembled all centromeres from a second human genome and compared it to the finished reference genome 4,5 . We find that the two sets of centromeres show at least a 4.1-fold increase in single-nucleotide variation when compared with their unique flanks and vary up to 3-fold in size. Moreover, we find that 45.8% of centromeric sequence cannot be reliably aligned using standard methods owing to the emergence of new α-satellite higher-order repeats (HORs). DNA methylation and CENP-A chromatin immunoprecipitation experiments show that 26% of the centromeres differ in their kinetochore position by >500 kb. To understand evolutionary change, we selected six chromosomes and sequenced and assembled 31 orthologous centromeres from the common chimpanzee, orangutan and macaque genomes. Comparative analyses reveal a nearly complete turnover of α-satellite HORs, with characteristic idiosyncratic changes in α-satellite HORs for each species. Phylogenetic reconstruction of human haplotypes supports limited to no recombination between the short (p) and long (q) arms across centromeres and reveals that novel α-satellite HORs share a monophyletic origin, providing a strategy to estimate the rate of saltatory amplification and mutation of human centromeric DNA.

ABSTRACT The crab-eating macaques ( Macaca fascicularis ) and rhesus macaques ( M. mulatta ) are widely studied nonhuman primates in biomedical and evolutionary research. Despite their significance, the current understanding of the complex genomic structure in macaques and the differences between species requires substantial improvement. Here, we present a complete genome assembly of a crab-eating macaque and 20 haplotype-resolved macaque assemblies to investigate the complex regions and major genomic differences between species. Segmental duplication in macaques is ∼42% lower, while centromeres are ∼3.7 times longer than those in humans. The characterization of ∼2 Mbp fixed genetic variants and ∼240 Mbp complex loci highlights potential associations with metabolic differences between the two macaque species (e.g., CYP2C76 and EHBP1L1 ). Additionally, hundreds of alternative splicing differences show post-transcriptional regulation divergence between these two species (e.g., PNPO ). We also characterize 91 large-scale genomic differences between macaques and humans at a single-base-pair resolution and highlight their impact on gene regulation in primate evolution (e.g., FOLH1 and PIEZO2 ). Finally, population genetics recapitulates macaque speciation and selective sweeps, highlighting potential genetic basis of reproduction and tail phenotype differences (e.g., STAB1 , SEMA3F , and HOXD13 ). In summary, the integrated analysis of genetic variation and population genetics in macaques greatly enhances our comprehension of lineage-specific phenotypes, adaptation, and primate evolution, thereby improving their biomedical applications in human diseases.

Apes possess two sex chromosomes—the male-specific Y and the X shared by males and females. The Y chromosome is crucial for male reproduction, with deletions linked to infertility. The X chromosome carries genes vital for reproduction and cognition. Variation in mating patterns and brain function among great apes suggests corresponding differences in their sex chromosome structure and evolution. However, due to their highly repetitive nature and incomplete reference assemblies, ape sex chromosomes have been challenging to study. Here, using the state-of-the-art experimental and computational methods developed for the telomere-to-telomere (T2T) human genome, we produced gapless, complete assemblies of the X and Y chromosomes for five great apes (chimpanzee, bonobo, gorilla, Bornean and Sumatran orangutans) and a lesser ape, the siamang gibbon. These assemblies completely resolved ampliconic, palindromic, and satellite sequences, including the entire centromeres, allowing us to untangle the intricacies of ape sex chromosome evolution. We found that, compared to the X, ape Y chromosomes vary greatly in size and have low alignability and high levels of structural rearrangements. This divergence on the Y arises from the accumulation of lineage-specific ampliconic regions and palindromes (which are shared more broadly among species on the X) and from the abundance of transposable elements and satellites (which have a lower representation on the X). Our analysis of Y chromosome genes revealed lineage-specific expansions of multi-copy gene families and signatures of purifying selection. In summary, the Y exhibits dynamic evolution, while the X is more stable. Finally, mapping short-read sequencing data from >100 great ape individuals revealed the patterns of diversity and selection on their sex chromosomes, demonstrating the utility of these reference assemblies for studies of great ape evolution. These complete sex chromosome assemblies are expected to further inform conservation genetics of nonhuman apes, all of which are endangered species.

In the latest hg38 human genome assembly, centromeric gaps has been filled in by alpha satellite (AS) reference models (RMs) which are statistical representations of homogeneous higher-order repeat (HOR) arrays that make up the bulk of the centromeric regions. We studied these models to compose an atlas of human HORs where each monomer of a HOR could be characterized and represented by a number of its polymorphic sequence variants. We further used these data and HMMER sequence analysis platform to annotate AS HORs in the assembly. This led to discovery and annotation of a new type of low copy number highly divergent HORs which were not represented by RMs. The annotation can be viewed as UCSC Genome Browser custom track (the HOR-track) and used together with our previous annotation of AS SFs in the same assembly where each AS monomer can be viewed in its genomic context together with its classification into one of the 5 major SFs (the SF-track). To catalog the diversity of AS HORs in the human genome we introduced a new naming system. Each HOR received a name which showed its SF, chromosomal location and index number. Here we present the first installment of the HOR-track covering only the 17 HORs that belong to SF1 which forms live functional centromeres in chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16 and 19 and also a large number of minor dead HOR domains, both homogeneous (pseudo) and divergent (relic). The 4 newly discovered divergent SF1 HORs have provided the missing links in SF1 early evolution and substantiated its partition into 2 generations, archaic and modern, which we reported earlier. Additionally, we demonstrated that monomer-by-monomer HOR annotation was useful for mapping and quantification of various structural variants of AS HORs which would be important for studies of inter-individual polymorphism of AS including centromeric functional epialleles.

The human Y chromosome has been notoriously difficult to sequence and assemble because of its complex repeat structure including long palindromes, tandem repeats, and segmental duplications 1–3 . As a result, more than half of the Y chromosome is missing from the GRCh38 reference sequence and it remains the last human chromosome to be finished 4, 5 . Here, the Telomere-to-Telomere (T2T) consortium presents the complete 62,460,029 base pair sequence of a human Y chromosome from the HG002 genome (T2T-Y) that corrects multiple errors in GRCh38-Y and adds over 30 million base pairs of sequence to the reference, revealing the complete ampliconic structures of TSPY , DAZ , and RBMY gene families; 41 additional protein-coding genes, mostly from the TSPY family; and an alternating pattern of human satellite 1 and 3 blocks in the heterochromatic Yq12 region. We have combined T2T-Y with a prior assembly of the CHM13 genome 4 and mapped available population variation, clinical variants, and functional genomics data to produce a complete and comprehensive reference sequence for all 24 human chromosomes.

We completely sequenced and assembled all centromeres from a second human genome and used two reference sets to benchmark genetic, epigenetic, and evolutionary variation within centromeres from a diversity panel of humans and apes. We find that centromere single-nucleotide variation can increase by up to 4.1-fold relative to other genomic regions, with the caveat that up to 45.8% of centromeric sequence, on average, cannot be reliably aligned with current methods due to the emergence of new α-satellite higher-order repeat (HOR) structures and two to threefold differences in the length of the centromeres. The extent to which this occurs differs depending on the chromosome and haplotype. Comparing the two sets of complete human centromeres, we find that eight harbor distinctly different α-satellite HOR array structures and four contain novel α-satellite HOR variants in high abundance. DNA methylation and CENP-A chromatin immunoprecipitation experiments show that 26% of the centromeres differ in their kinetochore position by at least 500 kbp-a property not readily associated with novel α-satellite HORs. To understand evolutionary change, we selected six chromosomes and sequenced and assembled 31 orthologous centromeres from the common chimpanzee, orangutan, and macaque genomes. Comparative analyses reveal nearly complete turnover of α-satellite HORs, but with idiosyncratic changes in structure characteristic to each species. Phylogenetic reconstruction of human haplotypes supports limited to no recombination between the p- and q-arms of human chromosomes and reveals that novel α-satellite HORs share a monophyletic origin, providing a strategy to estimate the rate of saltatory amplification and mutation of human centromeric DNA.