Abstract The role of different cell types and their interactions in Alzheimer’s disease (AD) is an open question. Here we pursued it by assembling a high-resolution cellular map of the aging frontal cortex by single nucleus RNA-seq of 24 individuals with different clinicopathologic characteristics. We used the map to infer the neocortical cellular architecture of 638 individuals profiled by bulk RNA-seq, providing the sample size necessary for identifying statistically robust associations. We uncovered diverse cell populations associated with AD, including inhibitory neuronal subtypes and oligodendroglial states. We further recovered a network of multicellular communities, each composed of coordinated subpopulations of neuronal, glial and endothelial cells, and found that two of these communities are altered in AD. Finally, we used mediation analyses to prioritize cellular changes that might contribute to cognitive decline. Thus, our deconstruction of the aging neocortex provides a roadmap for evaluating the cellular microenvironments underlying AD and dementia.

ABSTRACT Epigenome-wide association studies of Alzheimer’s disease have highlighted neuropathology-associated DNA methylation differences, although existing studies have been limited in sample size and utilized different brain regions. Here, we combine data from six DNA methylomic studies of Alzheimer’s disease (N=1,453 unique individuals) to identify differential methylation associated with Braak stage in different brain regions and across cortex. We identify 236 CpGs in the prefrontal cortex, 95 CpGs in the temporal gyrus and ten CpGs in the entorhinal cortex at Bonferroni significance, with none in the cerebellum. Our cross-cortex meta-analysis (N=1,408 donors) identifies 220 CpGs associated with neuropathology, annotated to 121 genes, of which 84 genes have not been previously reported at this significance threshold. We have replicated our findings using two further DNA methylomic datasets consisting of a further > 600 unique donors. The meta-analysis summary statistics are available in our online data resource ( www.epigenomicslab.com/ad-meta-analysis/ ).

Abstract Recent studies of bulk microglia have provided insights into the role of this immune cell type in central nervous system development, homeostasis and dysfunction. Nonetheless, our understanding of the diversity of human microglial cell states remains limited; microglia are highly plastic and have multiple different roles, making the extent of phenotypic heterogeneity a central question, especially in light of the development of therapies targeting this cell type. Here, we investigated the population structure of human microglia by single-cell RNA-sequencing. Using surgical- and autopsy-derived cortical brain samples, we identified 14 human microglial subpopulations and noted substantial intra- and inter-individual heterogeneity. These putative subpopulations display divergent associations with Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, and other diseases. Several states show enrichment for genes found in disease-associated mouse microglial states, suggesting additional diversity among human microglia. Overall, human microglia appear to exist in different functional states with varying levels of involvement in different brain pathologies.

Abstract The biological processes that are disrupted in the Alzheimer’s disease (AD) brain remain incompletely understood. We recently performed a proteomic analysis of >2000 brains to better understand these changes, which highlighted alterations in astrocytes and microglia as likely key drivers of disease. Here, we extend this analysis by analyzing >1000 brain tissues using a tandem mass tag mass spectrometry (TMT-MS) pipeline, which allowed us to nearly triple the number of quantified proteins across cases. A consensus protein co-expression network analysis of this deeper dataset revealed new co-expression modules that were highly preserved across cohorts and brain regions, and strongly altered in AD. Nearly half of the protein co-expression modules, including modules significantly altered in AD, were not observed in RNA networks from the same cohorts and brain regions, highlighting the proteopathic nature of AD. Two such AD-associated modules unique to the proteomic network included a module related to MAPK signaling and metabolism, and a module related to the matrisome. Analysis of paired genomic and proteomic data within subjects showed that expression level of the matrisome module was influenced by the APOE ε4 allele, but was not related to the rate of cognitive decline after adjustment for neuropathology. In contrast, the MAPK/metabolism module was strongly associated with the rate of cognitive decline. Disease-associated modules unique to the proteome are sources of promising therapeutic targets and biomarkers for AD.

ABSTRACT We use deep sequencing to identify sources of variation in mRNA splicing in the dorsolateral prefrontal cortex (DLFPC) of 450 subjects from two prospective cohort studies of aging. Hundreds of aberrant pre-mRNA splicing events are reproducibly associated with Alzheimer’s Disease (AD). We also generate a catalog of splicing quantitative trait loci (sQTL) effects in the human cortex: splicing of 3,198 genes is influenced by genetic variation. sQTLs are enriched among those variants influencing DNA methylation and histone acetylation. In assessing known AD loci, we report that altered splicing is the mechanism for the effects of the PICALM, CLU, and PTK2B susceptibility alleles. Further, we leverage our sQTL catalog to identify genes whose aberrant splicing is associated with AD and mediated by genetics. This transcriptome-wide association study identified 21 genes with significant associations, many of which are found in AD GWAS loci, but 8 are in novel AD loci, including FUS, which is a known amyotrophic lateral sclerosis (ALS) gene. This highlights an intriguing shared genetic architecture that is further elaborated by the convergence of old and new AD genes in autophagy-lysosomal-related pathways already implicated in AD and other neurodegenerative diseases. Overall, this study of the aging brain’s transcriptome provides evidence that dysregulation of mRNA splicing is a feature of AD and is, in some genetically-driven cases, causal.

Abstract Characterizing the intermediate phenotypes, such as gene expression, that mediate genetic effects on complex diseases is a fundamental problem in human genetics. Existing methods utilize genotypic data and summary statistics to identify putative disease genes, but cannot distinguish pleiotropy from causal mediation and are limited by overly strong assumptions about the data. To overcome these limitations, we develop Causal Multivariate Mediation within Extended Linkage disequilibrium (CaMMEL), a novel Bayesian inference framework to jointly model multiple mediated and unmediated effects relying only on summary statistics. We show in simulation that CaMMEL accurately distinguishes between mediating and pleiotropic genes unlike existing methods. We applied CaMMEL to Alzheimer’s disease (AD) and found 206 causal genes in sub-threshold loci (p < 10 −4 ). We prioritized 21 genes which mediate at least 5% of local genetic variance, disrupting innate immune pathways in AD.

Abstract Ethnicity impacts Alzheimer’s disease risk, especially among Caribbean-Hispanics. We report the first RNA-sequencing analysis of brain tissue from 45 Alzheimer’s disease and control Caribbean-Hispanics. Data were compared with two independent samples of non-Hispanic Caucasians (total n=729). By identifying and characterizing those genes with ancestry- and region-specific expression patterns in Alzheimer’s disease, we reveal molecular insights that may help explain epidemiological disparities in this understudied aging population.

Abstract The hallmark amyloid-β and tau deposition of Alzheimer’s disease (AD) represents only a fraction of its diverse pathophysiology. Molecular subtyping using large-scale -omic strategies can help resolve this biological heterogeneity. Using quantitative mass spectrometry, we measured ~8,000 proteins across >600 dorsolateral prefrontal cortex tissues from Religious Orders Study and Rush Memory and Aging Project participants with clinical diagnoses of no cognitive impairment, mild cognitive impairment (MCI), and AD dementia. Unbiased classification of MCI and AD cases based on individual proteomic profiles resolved three classes with expression differences across numerous cell types and biological ontologies. Two classes displayed molecular signatures atypical of those previously observed in AD neurodegeneration, such as elevated synaptic and decreased inflammatory markers. In one class, these atypical proteomic features were associated with clinical and pathological hallmarks of cognitive resilience. These results promise to better define disease heterogeneity within AD and meaningfully impact its diagnostic and therapeutic precision.

Summary Alzheimer’s disease (AD) is an age-associated neurodegenerative disorder characterized by progressive neuronal loss and pathological accumulation of the misfolded proteins amyloid-β and tau 1,2 . Neuroinflammation mediated by microglia and brain-resident macrophages plays a crucial role in AD pathogenesis 1–5 , though the mechanisms by which age, genes, and other risk factors interact remain largely unknown. Somatic mutations accumulate with age and lead to clonal expansion of many cell types, contributing to cancer and many non-cancer diseases 6,7 . Here we studied somatic mutation in normal aged and AD brains by three orthogonal methods and in three independent AD cohorts. Analysis of bulk RNA sequencing data from 866 samples from different brain regions revealed significantly higher (∼two-fold) overall burdens of somatic single-nucleotide variants (sSNVs) in AD brains compared to age-matched controls. Molecular-barcoded deep (>1000X) gene panel sequencing of 311 prefrontal cortex samples showed enrichment of sSNVs and somatic insertions and deletions (sIndels) in cancer driver genes in AD brain compared to control, with recurrent, and often multiple, mutations in genes implicated in clonal hematopoiesis (CH) 8,9 . Pathogenic sSNVs were enriched in CSF1R+ microglia of AD brains, and the high proportion of microglia (up to 40%) carrying some sSNVs in cancer driver genes suggests mutation-driven microglial clonal expansion (MiCE). Analysis of single-nucleus RNA sequencing (snRNAseq) from temporal neocortex of 62 additional AD cases and controls exhibited nominally increased mosaic chromosomal alterations (mCAs) associated with CH 10,11 . Microglia carrying mCA showed upregulated pro-inflammatory genes, resembling the transcriptomic features of disease-associated microglia (DAM) in AD. Our results suggest that somatic driver mutations in microglia are common with normal aging but further enriched in AD brain, driving MiCE with inflammatory and DAM signatures. Our findings provide the first insights into microglial clonal dynamics in AD and identify potential new approaches to AD diagnosis and therapy.

Abstract Transcriptome-wide association studies (TWAS) have been widely used to integrate transcriptomic and genetic data to study complex human diseases. Within a test dataset lacking transcriptomic data, existing TWAS methods first impute gene expression by creating a weighted sum that aggregates SNPs with their corresponding cis-eQTL effects on reference transcriptome. Existing TWAS methods then employ a linear regression model to assess the association between imputed gene expression and test phenotype, thereby assuming the effect of a cis-eQTL SNP on test phenotype is a linear function of the eQTL’s estimated effect on reference transcriptome. To increase TWAS robustness to this assumption, we propose a novel Variance-Component TWAS procedure (VC-TWAS) that assumes the effects of cis-eQTL SNPs on phenotype are random (with variance proportional to corresponding reference cis-eQTL effects) rather than fixed. VC-TWAS is applicable to both continuous and dichotomous phenotypes, as well as individual-level and summary-level GWAS data. Using simulated data, we show VC-TWAS is more powerful than traditional TWAS especially when eQTL genetic effects on test phenotype are no longer a linear function of their eQTL genetic effects on reference transcriptome. We further applied VC-TWAS to both individual-level (N=∼3.4K) and summary-level (N=∼54K) GWAS data to study Alzheimer’s dementia (AD). With the individual-level data, we detected 13 significant risk genes including 6 known GWAS risk genes such as TOMM40 that were missed by existing TWAS methods. With the summary-level data, we detected 57 significant risk genes considering only cis-SNPs and 71 significant genes considering both cis- and trans- SNPs; these findings also validated our findings with the individual-level GWAS data. Our VC-TWAS method is implemented in the TIGAR tool for public use. Author Summary Existing Transcriptome-wide association studies (TWAS) tools make strong assumptions about the relationships among genetic variants, transcriptome, and phenotype that may be violated in practice, thereby substantially reducing the power. Here, we propose a novel variance-component TWAS method (VC-TWAS) that relaxes these assumptions and can be implemented with both individual-level and summary-level GWAS data. Our simulation studies showed that VC-TWAS achieved higher power compared to existing TWAS methods when the underlying assumptions required by existing TWAS tools were violated. We further applied VC-TWAS to both individual-level (N=∼3.4K) and summary-level (N=∼54K) GWAS data to study Alzheimer’s dementia (AD). With individual-level data, we detected 13 significant risk genes including 6 known GWAS risk genes such as TOMM40 that were missed by existing TWAS methods. Interestingly, 5 of these genes were shown to possess significant pleiotropic effects on AD pathology phenotypes, revealing possible biological mechanisms. With summary-level data of a larger sample size, we detected 57 significant risk genes considering only cis-SNPs and 71 significant genes considering both cis- and trans- SNPs, which also validated our findings with the individual-level GWAS data. In conclusion, VC-TWAS provides an important analytic tool for identifying risk genes whose effects on phenotypes might be mediated through transcriptomes.