Comprehensive, reproducible and precise analysis of large sample cohorts is one of the key objectives of quantitative proteomics. Here, we present an implementation of data-independent acquisition using its parallel acquisition nature that surpasses the limitation of serial MS2 acquisition of data-dependent acquisition on a quadrupole ultra-high field Orbitrap mass spectrometer. In deep single shot data-independent acquisition, we identified and quantified 6,383 proteins in human cell lines using 2-or-more peptides/protein and over 7100 proteins when including the 717 proteins that were identified on the basis of a single peptide sequence. 7739 proteins were identified in mouse tissues using 2-or-more peptides/protein and 8121 when including the 382 proteins that were identified based on a single peptide sequence. Missing values for proteins were within 0.3 to 2.1% and median coefficients of variation of 4.7 to 6.2% among technical triplicates. In very complex mixtures, we could quantify 10,780 proteins and 12,192 proteins when including the 1412 proteins that were identified based on a single peptide sequence. Using this optimized DIA, we investigated large-protein networks before and after the critical period for whisker experience-induced synaptic strength in the murine somatosensory cortex 1-barrel field. This work shows that parallel mass spectrometry enables proteome profiling for discovery with high coverage, reproducibility, precision and scalability.

Abstract Achieving sufficient coverage of regulatory phosphorylation sites by mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics for signaling pathway reconstitution is challenging when analyzing tiny sample amounts. We present a novel hybrid data-independent acquisition (DIA) strategy (hybrid-DIA) that combines targeted and discovery proteomics through an Application Programming Interface (API) to dynamically intercalate DIA scans with accurate triggering of multiplexed tandem MS scans of predefined (phospho)peptide targets. By spiking-in heavy stable isotope labeled phosphopeptide standards covering seven major signaling pathways, we benchmarked hybrid-DIA against state-of-the-art targeted MS methods (i.e. SureQuant) using EGF-stimulated HeLa cells and found the quantitative accuracy and sensitivity to be comparable while hybrid-DIA also profiled the global phosphoproteome. To demonstrate the robustness, sensitivity and potential of hybrid-DIA, we profiled chemotherapeutic agents in single colon carcinoma multicellular spheroids and evaluated the difference of cancer cells in 2D vs 3D culture. Altogether, we showed that hybrid-DIA is the way-to-go method in highly sensitive phospho-proteomics experiments.

Clinical biomarker development has been stymied by inaccurate protein quantification from mass spectrometry (MS) discovery data and a prolonged validation process. To mitigate these issues, we created the Targeted Extraction Assessment of Quantification (TEAQ) software package. This innovative tool uses the discovery cohort analysis to select precursors, peptides, and proteins that adhere to established targeted assay criteria. TEAQ was applied to Data-Independent Acquisition MS data from plasma samples acquired on an Orbitrap™ Astral™ MS. Identified precursors were evaluated for linearity, specificity, repeatability, reproducibility, and intra-protein correlation from 11-point loading curves under three throughputs, to develop a resource for clinical-grade targeted assays. From a clinical cohort of individuals with inflammatory bowel disease (n=492), TEAQ successfully identified 1116 signature peptides for 327 quantifiable proteins from 1180 identified proteins. Embedding stringent selection criteria adaptable to targeted assay development into the analysis of discovery data will streamline the transition to validation and clinical studies.

To answer the increasing need for detecting and validating protein biomarkers in clinical specimens, proteomic techniques are required that support the fast, reproducible and quantitative analysis of large clinical sample cohorts. Targeted mass spectrometry techniques, specifically SRM, PRM and the massively parallel SWATH/DIA technique have emerged as a powerful method for biomarker research. For optimal performance, they require prior knowledge about the fragment ion spectra of targeted peptides. In this report, we describe a mass spectrometric (MS) pipeline and spectral resource to support data-independent acquisition (DIA) and parallel reaction monitoring (PRM) based biomarker studies. To build the spectral resource we integrated common open-source MS computational tools to assemble an open source computational workflow based on Docker. It was then applied to generate a comprehensive DIA pan-human library (DPHL) from 1,096 data dependent acquisition (DDA) MS raw files, and it comprises 242,476 unique peptide sequences from 14,782 protein groups and 10,943 SwissProt-annotated proteins expressed in 16 types of cancer samples. In particular, tissue specimens from patients with prostate cancer, cervical cancer, colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung carcinoma, diseased thyroid, glioblastoma multiforme, sarcoma and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), as well as plasma samples from a range of hematologic malignancies were collected from multiple clinics in China, the Netherlands and Singapore and included in the resource. This extensive spectral resource was then applied to a prostate cancer cohort of 17 patients, consisting of 8 patients with prostate cancer (PCa) and 9 with benign prostate hyperplasia (BPH), respectively. Data analysis of DIA data from these samples identified differential expressions of FASN, TPP1 and SPON2 in prostate tumors. Thereafter, PRM validation was applied to a larger PCa cohort of 57 patients and the differential expressions of FASN, TPP1 and SPON2 in prostate tumors were validated. As a second application, the DPHL spectral resource was applied to a patient cohort consisting of samples from 19 DLBCL patients and 18 healthy individuals. Differential expressions of CRP, CD44 and SAA1 between DLBCL cases and healthy controls were detected by DIA-MS and confirmed by PRM. These data demonstrate that the DPHL supported that DIA-PRM MS pipeline enables robust protein biomarker discoveries.

Abstract Mass spectrometry (MS)-based proteomics aims to characterize comprehensive proteomes in a fast and reproducible manner. Here, we present an ultra-fast scanning data-independent acquisition (DIA) strategy consisting on 2-Th precursor isolation windows, dissolving the differences between data-dependent and independent methods. This is achieved by pairing a Quadrupole Orbitrap mass spectrometer with the asymmetric track lossless (Astral) analyzer that provides >200 Hz MS/MS scanning speed, high resolving power and sensitivity, as well as low ppm-mass accuracy. Narrow-window DIA enables profiling of up to 100 full yeast proteomes per day, or ∼10,000 human proteins in half-an-hour. Moreover, multi-shot acquisition of fractionated samples allows comprehensive coverage of human proteomes in ∼3h, showing comparable depth to next-generation RNA sequencing and with 10x higher throughput compared to current state-of-the-art MS. High quantitative precision and accuracy is demonstrated with high peptide coverage in a 3-species proteome mixture, quantifying 14,000+ proteins in a single run in half-an-hour. Teaser Accurate and precise label-free quantification with comprehensive proteome coverage using narrow-window DIA

Cancer has no borders: Generation and analysis of molecular data across multiple centers worldwide is necessary to gain statistically significant clinical insights for the benefit of patients. Here we conceived and standardized a proteotype data generation and analysis workflow enabling distributed data generation and evaluated the quantitative data generated across laboratories of the international Cancer Moonshot consortium. Using harmonized mass spectrometry (MS) instrument platforms and standardized data acquisition procedures, we demonstrated robust, sensitive, and reproducible data generation across eleven sites in nine countries on seven consecutive days in a 24/7 operation mode. The data presented from the high-resolution MS1-based quantitative data-independent acquisition (HRMS1-DIA) workflow shows that coordinated proteotype data acquisition is feasible from clinical specimens using such standardized strategies. This work paves the way for the distributed multi-omic digitization of large clinical specimen cohorts across multiple sites as a prerequisite for turning molecular precision medicine into reality.