Abstract: A rapid and simple procedure is presented to obtain nearly pure populations of human neuron‐like cells from the SH‐SY5Y neuroblastoma cell line. Sequential exposure of SH‐SY5Y cells to retinoic acid and brain‐derived neurotrophic factor in serum‐free medium yields homogeneous populations of cells with neuronal morphology, avoiding the presence of other neural crest derivatives that would normally arise from those cells. Cells are withdrawn from the cell cycle, as shown by 5‐bromo‐2′‐deoxyuridine uptake and retinoblastoma hypophosphorylation. Cell survival is dependent on the continuous presence of brain‐derived neurotrophic factor, and removal of this neurotrophin causes apoptotic cell death accompanied by an attempt to reenter the cell cycle. Differentiated cells express neuronal markers, including neurofilaments, neuron‐specific enolase, and growth‐associated protein‐43 as well as neuronal polarity markers such as tau and microtubule‐associated protein 2. Moreover, differentiated cultures do not contain glial cells, as could be evidenced after the negative staining for glial fibrillary acidic protein. In conclusion, the protocol presented herein yields homogeneous populations of human neuronal differentiated cells that present many of the characteristics of primary cultures of neurons. This model may be useful to perform large‐scale biochemical and molecular studies due to its susceptibility to genetic manipulation and the availability of an unlimited amount of cells.

ABSTRACT During T-cell activation, the transmembrane adaptor Linker of Activation of T-cells (LAT) forms biomolecular condensates with Grb2 and Sos1, facilitating signaling. LAT has also been associated with cholesterol-rich condensed lipid domains. However, the potential coupling between protein condensation and lipid phase separation and its role in organizing T-cell signaling were unknown. Here, we report that LAT/Grb2/Sos1 condensates reconstituted on model membranes can induce and template lipid domains, indicating strong coupling between lipid- and protein-based phase separation. Correspondingly, activation of T-cells induces protein condensates that associate with and stabilize raft-like membrane domains. Inversely, lipid domains nucleate and stabilize LAT protein condensates in both reconstituted and living systems. This coupling of lipid and protein assembly is functionally important, since uncoupling of lipid domains from cytoplasmic protein condensates abrogates T-cell activation. Thus, thermodynamic coupling between protein condensates and ordered lipid domains regulates the functional organization of living membranes. SUMMARY Membrane-associated protein condensates couple to ordered membrane domains to determine the functional organization of T-cell plasma membranes

Abstract Recently identified palmitoylation of PD-L1 is essential for immune regulation. To elucidate the underlying molecular mechanism, we performed giant plasma membrane vesicle (GPMV) experiments, µs-scale all-atom molecular dynamics (MD) simulations and immune killing experiments. GPMV experiments indicated that PD-L1 palmitoylation enhanced its lipid raft affinity. MD simulations revealed dramatically different membrane orientation states of PD-L1 in liquid-ordered ( L o , lipid raft) compared to liquid-disordered ( L d , non-raft) membrane environments. L d region promoted the “lie-down” orientation of PD-L1, which could inhibit its association with the PD-1 protein on immune cells and thus promote the immune killing of cancer cells. This hypothesis was supported by immune killing experiments using γδ T cells as effector cells and NCI-H1299 lung cancer cells as target cells. In short, our study demonstrates that the palmitoylation affects PD-L1’s membrane localization and then membrane orientation, which thus regulates its binding with T cell PD-1 and the immune regulation. These observations may guide therapeutic strategies by explicating the regulation of immune checkpoint proteins by post-translational modifications and membrane environments.

ABSTRACT Membranes are molecular interfaces that insulate cells from external stresses, compartmentalize the cytoplasm, and control the flow of nutrients and information 1 . These functions are facilitated by diverse collections of lipids, nearly all of which are distributed asymmetrically between the two leaflets of living bilayers 2,3 . Previous models of biomembrane structure and function have rested upon the implicit assumption that the two membrane leaflets have similar abundances of phospholipids. Here, we show that this assumption is generally invalid and investigate the consequences of lipid abundance imbalances in mammalian plasma membranes (PM). Using quantitative lipidomics, we discovered that cytoplasmic leaflets of human erythrocyte PMs have >50% overabundance of phospholipids compared to exoplasmic leaflets. We show that this phospholipid imbalance is enabled by an asymmetric interleaflet distribution of cholesterol 4,5 , which rapidly redistributes to buffer leaflet stresses. Asymmetric phospholipid abundance and composition combine to enrich cholesterol in the exoplasmic PM leaflet. Through a combination of experimental and computational approaches we demonstrate how these lipid distributions impart unique functional characteristics to PMs, including low permeability, surprisingly fast cholesterol diffusion 6 , and resting tension in the cytoplasmic monolayer that regulates protein localization. Our observations of these previously overlooked aspects of membrane asymmetry represent an evolution of classic paradigms 1,7 of biomembrane structure and physiology.