The majority of proteins tend to bind to one or several copies of themselves and assemble as 'homo-oligomeric' complexes — or homomers. Based on the known crystallographic structures of 5,000 such complexes, Levy et al. have derived plausible pathways for the emergence of ever more complex such assemblies during evolution. Using electrospray mass spectrometry, they observe that the same pathways are followed on the shorter timescale of protein assembly in vitro. Homophilic protein interactions are fundamental in biochemical processes such as allostery and the predictive method developed here should help targeting drugs to protein–protein interfaces more efficiently. On the basis of the known crystallographic structures of 5000 'homo-oligomeric' complexes, this study derives plausible pathways for the emergence of ever more complex such assemblies during evolution. Using electrospray mass spectrometry, it is observed that the same pathways are followed on the shorter time-scale of protein assembly in vitro. A homomer is formed by self-interacting copies of a protein unit. This is functionally important1,2, as in allostery3,4,5, and structurally crucial because mis-assembly of homomers is implicated in disease6,7. Homomers are widespread, with 50–70% of proteins with a known quaternary state assembling into such structures8,9. Despite their prevalence, their role in the evolution of cellular machinery10,11 and the potential for their use in the design of new molecular machines12,13, little is known about the mechanisms that drive formation of homomers at the level of evolution and assembly in the cell9,14. Here we present an analysis of over 5,000 unique atomic structures and show that the quaternary structure of homomers is conserved in over 70% of protein pairs sharing as little as 30% sequence identity. Where quaternary structure is not conserved among the members of a protein family, a detailed investigation revealed well-defined evolutionary pathways by which proteins transit between different quaternary structure types. Furthermore, we show by perturbing subunit interfaces within complexes and by mass spectrometry analysis15, that the (dis)assembly pathway mimics the evolutionary pathway. These data represent a molecular analogy to Haeckel’s evolutionary paradigm of embryonic development, where an intermediate in the assembly of a complex represents a form that appeared in its own evolutionary history. Our model of self-assembly allows reliable prediction of evolution and assembly of a complex solely from its crystal structure.

Most of the proteins in a cell assemble into complexes to carry out their function. It is therefore crucial to understand the physicochemical properties as well as the evolution of interactions between proteins. The Protein Data Bank represents an important source of information for such studies, because more than half of the structures are homo- or heteromeric protein complexes. Here we propose the first hierarchical classification of whole protein complexes of known 3-D structure, based on representing their fundamental structural features as a graph. This classification provides the first overview of all the complexes in the Protein Data Bank and allows nonredundant sets to be derived at different levels of detail. This reveals that between one-half and two-thirds of known structures are multimeric, depending on the level of redundancy accepted. We also analyse the structures in terms of the topological arrangement of their subunits and find that they form a small number of arrangements compared with all theoretically possible ones. This is because most complexes contain four subunits or less, and the large majority are homomeric. In addition, there is a strong tendency for symmetry in complexes, even for heteromeric complexes. Finally, through comparison of Biological Units in the Protein Data Bank with the Protein Quaternary Structure database, we identified many possible errors in quaternary structure assignments. Our classification, available as a database and Web server at http://www.3Dcomplex.org, will be a starting point for future work aimed at understanding the structure and evolution of protein complexes.

The mesoscale organization of molecules into membraneless biomolecular condensates is emerging as a key mechanism of rapid spatiotemporal control in cells. Principles of biomolecular condensation have been revealed through reconstitution. However, intracellular environments are much more complex than test-tube environments: they are viscoelastic, highly crowded at the mesoscale, and are far from thermodynamic equilibrium due to the constant action of energy-consuming processes. We developed synDrops, a synthetic phase separation system, to study how the cellular environment affects condensate formation. Three key features enable physical analysis: synDrops are inducible, bioorthogonal, and have well-defined geometry. This design allows kinetic analysis of synDrop assembly and facilitates computational simulation of the process. We compared experiments and simulations to determine that macromolecular crowding promotes condensate nucleation but inhibits droplet growth through coalescence. ATP-dependent cellular activities help overcome the frustration of growth. In particular, stirring of the cytoplasm by actomyosin dynamics is the dominant mechanism that potentiates droplet growth in the mammalian cytoplasm by reducing confinement and elasticity. Our results demonstrate that mesoscale molecular assembly is favored by the combined effects of crowding and active matter in the cytoplasm. These results move toward a better predictive understanding of condensate formation . Published by the American Physical Society 2024

ABSTRACT The assembly of proteins into functional complexes is critical to life’s processes. While textbooks depict complex assembly as occurring between fully synthesized proteins, we know today that thousands of proteins in the human proteome assemble co-translationally during their synthesis. Why this process takes place, however, remains unknown. We show that co-translational assembly is governed by biophysical and structural characteristics of the protein complex, and involves mutually stabilized, intertwined subunits. Consequently, these subunits are also co-regulated across the central dogma, from transcription to protein degradation. Leveraging structural signatures with AlphaFold2-based predictions enables us to accurately predict co-translational assembly on a proteome-wide scale, which we validated by ribosome profiling, genetic perturbations, and smFISH experiments. Notably, the latter showed that co-translationally assembling subunits exhibit co-localized mRNAs. This work unveils a fundamental connection between protein structure and the translation process, highlighting the overarching impact of three-dimensional structure on gene expression, mRNA localization, and proteostasis. One Sentence Summary Protein complexes with topologically intertwined subunits require co-translational assembly and synchronized proteostasis of subunits, with implications in protein stability, mRNA localization, and evolution. Graphical Abstract

Here we describe a C-SWAT library for high-throughput tagging of Saccharomyces cerevisiae ORFs. It consists of 5661 strains with an acceptor module inserted after each ORF, which can be efficiently replaced with tags or regulatory elements. We validate the library with targeted sequencing and demonstrate its use by tagging the yeast proteome with bright fluorescent proteins, determining how sequences downstream of ORFs influence protein expression and localizing previously undetected proteins.

ABSTRACT α-Helical coiled coils are common tertiary and quaternary elements of protein structure. In coiled coils, two or more α helices wrapped around each other to form bundles. This apparently simple structural motif can generate many architectures and topologies. Understanding the variety of and limits on coiled-coil assemblies and their sequence-to-structure relationships impacts on protein structure, design, and engineering. Coiled coil-forming sequences can be predicted from heptad repeats of hydrophobic and polar residues, hpphppp , although this is not always reliable. Alternatively, coiled-coil structures can be identified using the program SOCKET, which finds knobs-into-holes (KIH) packing between side chains of neighboring helices. SOCKET also classifies coiled-coil architecture and topology, thus allowing sequence-to-structure relationships to be garnered. In 2009, we used SOCKET to create a relational database of coiled-coil structures, CC + , from the RCSB Protein Data Bank (PDB). Here we report an update of CC + following the recent explosion of structural data and the success of AlphaFold2 in predicting protein structures from genome sequences. With the most-stringent SOCKET parameters, CC + contains ≈12,000 coiled-coil assemblies from experimentally determined structures, and ≈120,000 potential coiled-coil structures within single-chain models predicted by AlphaFold2 across 48 proteomes. CC + allows these and other less-stringently defined coiled coils to be searched at various levels of structure, sequence, and side-chain interactions. The identified coiled coils can be viewed directly from CC + using the Socket2 application, and their associated data can be downloaded for further analyses. CC + is available freely at http://coiledcoils.chm.bris.ac.uk/CCPlus/Home.html . It will be regularly updated automatically. FOR THE BROADER AUDIENCE Protein assemblies and protein-protein interactions are key to all biological processes. α-Helical coiled coils are one of the most common modes of directing and stabilising these interfaces. Here, we report an updated CC + database of structurally validated coiled coils from experimental protein structures and AlphaFold2 models. CC + contains many thousands of coiled-coil structures and models, associated parameters, and sequences. It enables the compilation of rich datasets for advancing protein structure, design, and engineering research.

ABSTRACT Understanding the molecular consequences of mutations in proteins is essential to map genotypes to phenotypes and interpret the increasing wealth of genomic data. While mutations are known to disrupt protein structure and function, their potential to create new structures and localization phenotypes has not yet been mapped to a sequence space. To map this relationship, we employed two homo-oligomeric protein complexes where the internal symmetry exacerbates the impact of mutations. We mutagenized three surface residues of each complex and monitored the mutations’ effect on localization and assembly phenotypes in yeast cells. While surface mutations are classically viewed as benign, our analysis of several hundred mutants revealed they often trigger three main phenotypes in these proteins: nuclear localization, the formation of puncta, and fibers. Strikingly, more than 50% of random mutants induced one of these phenotypes in both complexes. Analyzing the mutant’s sequences showed that surface stickiness and net charge are two key physicochemical properties associated with these changes. In one complex, more than 60% of mutants self-assembled into fibers. Such a high frequency is explained by negative design: charged residues shield the complex from misassembly, and the sole removal of the charges induces its assembly. A subsequent analysis of several other complexes targeted with alanine mutations suggested that negative design against mis-assembly and mislocalization is common. These results highlight that minimal perturbations in protein surfaces’ physicochemical properties can frequently drive assembly and localization changes in a cellular context.

Abstract Membraneless organelles are cellular compartments that form by liquid-liquid phase separation of one or more components. Other molecules, such as other proteins and nucleic acids, will distribute between the cytoplasm and the liquid compartment in accordance with the thermodynamic drive to lower the free energy of the system. The resulting distribution colocalizes molecular species, to carry out a diversity of functions. Two factors could drive this partitioning: the difference in solvation between the dilute versus dense phase, and intermolecular interactions between the client and scaffold proteins. Here, we develop a set of knowledge-based potentials that allow for the direct comparison between desolvation energy and pairwise interaction energy terms, and use these to examine experimental data from two systems: protein cargo dissolving within phase-separated droplets made from FG repeat proteins of the nuclear pore complex, and client proteins dissolving within phase-separated FUS droplets. We find close agreement between desolvation energies of the client proteins and the experimentally determined values of the partition coefficients, while pairwise interaction energies between client and scaffold show weaker correlations. These results show that client stickiness is sufficient to explain differential partitioning of clients within these two phase-separated systems without taking into account the composition of the condensate. This suggests that selective trafficking of client proteins to distinct membraneless organelles requires recognition elements beyond the client sequence composition.