We previously reported that Parkinson’s disease (PD) kinase LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases on a conserved residue in their switch-II domains (Steger et al., 2016) (PMID: 26824392). Here, we systematically analyzed the Rab protein family and found 14 of them (Rab3A/B/C/D, Rab5A/B/C, Rab8A/B, Rab10, Rab12, Rab29, Rab35 and Rab43) to be specifically phosphorylated by LRRK2, with evidence for endogenous phosphorylation for ten of them (Rab3A/B/C/D, Rab8A/B, Rab10, Rab12, Rab35 and Rab43). Affinity enrichment mass spectrometry revealed that the primary ciliogenesis regulator, RILPL1 specifically interacts with the LRRK2-phosphorylated forms of Rab8A and Rab10, whereas RILPL2 binds to phosphorylated Rab8A, Rab10, and Rab12. Induction of primary cilia formation by serum starvation led to a two-fold reduction in ciliogenesis in fibroblasts derived from pathogenic LRRK2-R1441G knock-in mice. These results implicate LRRK2 in primary ciliogenesis and suggest that Rab-mediated protein transport and/or signaling defects at cilia may contribute to LRRK2-dependent pathologies.

Article6 December 2017Open Access Source DataTransparent process Rab29 activation of the Parkinson's disease-associated LRRK2 kinase Elena Purlyte Elena Purlyte MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Herschel S Dhekne Herschel S Dhekne Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Adil R Sarhan Adil R Sarhan orcid.org/0000-0003-2163-4910 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Rachel Gomez Rachel Gomez Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Pawel Lis Pawel Lis MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Melanie Wightman Melanie Wightman MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Terina N Martinez Terina N Martinez The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, New York, NY, USA Search for more papers by this author Francesca Tonelli Corresponding Author Francesca Tonelli [email protected] orcid.org/0000-0002-4600-6630 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Suzanne R Pfeffer Corresponding Author Suzanne R Pfeffer [email protected] orcid.org/0000-0002-6462-984X Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Dario R Alessi Corresponding Author Dario R Alessi [email protected] orcid.org/0000-0002-2140-9185 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Elena Purlyte Elena Purlyte MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Herschel S Dhekne Herschel S Dhekne Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Adil R Sarhan Adil R Sarhan orcid.org/0000-0003-2163-4910 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Rachel Gomez Rachel Gomez Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Pawel Lis Pawel Lis MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Melanie Wightman Melanie Wightman MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Terina N Martinez Terina N Martinez The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, New York, NY, USA Search for more papers by this author Francesca Tonelli Corresponding Author Francesca Tonelli [email protected] orcid.org/0000-0002-4600-6630 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Suzanne R Pfeffer Corresponding Author Suzanne R Pfeffer [email protected] orcid.org/0000-0002-6462-984X Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA Search for more papers by this author Dario R Alessi Corresponding Author Dario R Alessi [email protected] orcid.org/0000-0002-2140-9185 MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK Search for more papers by this author Author Information Elena Purlyte1,‡, Herschel S Dhekne2,‡, Adil R Sarhan1, Rachel Gomez2, Pawel Lis1, Melanie Wightman1, Terina N Martinez3, Francesca Tonelli *,1,‡, Suzanne R Pfeffer *,2 and Dario R Alessi *,1 1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK 2Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA 3The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, New York, NY, USA ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Tel: +44 1382 385602; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +1 650 725 5130; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +44 1382 385602; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2018)37:1-18https://doi.org/10.15252/embj.201798099 Correction(s) for this article Rab29 activation of the Parkinson's disease-associated LRRK2 kinase15 January 2019 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Parkinson's disease predisposing LRRK2 kinase phosphorylates a group of Rab GTPase proteins including Rab29, within the effector-binding switch II motif. Previous work indicated that Rab29, located within the PARK16 locus mutated in Parkinson's patients, operates in a common pathway with LRRK2. Here, we show that Rab29 recruits LRRK2 to the trans-Golgi network and greatly stimulates its kinase activity. Pathogenic LRRK2 R1441G/C and Y1699C mutants that promote GTP binding are more readily recruited to the Golgi and activated by Rab29 than wild-type LRRK2. We identify conserved residues within the LRRK2 ankyrin domain that are required for Rab29-mediated Golgi recruitment and kinase activation. Consistent with these findings, knockout of Rab29 in A549 cells reduces endogenous LRRK2-mediated phosphorylation of Rab10. We show that mutations that prevent LRRK2 from interacting with either Rab29 or GTP strikingly inhibit phosphorylation of a cluster of highly studied biomarker phosphorylation sites (Ser910, Ser935, Ser955 and Ser973). Our data reveal that Rab29 is a master regulator of LRRK2, controlling its activation, localization, and potentially biomarker phosphorylation. Synopsis The GTPase Rab29 is found as a master regulator of Parkinson's disease-associated LRRK2 kinase, suggesting that inhibitors that block Rab29 binding might inhibit LRRK2 activity and offer therapeutic potential for the treatment of Parkinson's disease. Rab29 recruits LRRK2 to the trans-Golgi network and greatly stimulates its kinase activity. Rab29 preferentially recruits and activates pathogenic LRRK2 mutants R1441G/C and Y1699C known to promote LRRK2 GTP binding. Rab29 binds to the ankyrin domain of LRRK2. LRRK2 mutations preventing either Rab29 or GTP binding inhibit phosphorylation of well-studied LRRK2 biomarker phosphorylation sites (S910, S935, S955, S973). Introduction Autosomal dominant missense mutations within the leucine-rich repeat protein kinase 2 (LRRK2) gene predispose to Parkinson's disease (Paisan-Ruiz et al, 2004; Zimprich et al, 2004). Mutations in LRRK2 account for ~5% of familial Parkinson's, and are observed in ~1% of sporadic Parkinson's patients, making LRRK2 one of the most commonly mutated genes linked to Parkinson's disease (Simon-Sanchez et al, 2009). LRRK2 is a large, multi-domain protein kinase consisting of an armadillo repeat domain (residues 150–510), an ankyrin domain (residues 690–860), leucine-rich repeats (residues 984–1278), a ROC-type GTPase domain (residues 1335–1510) that closely resembles a Rab GTPase and is associated with a COR domain (C-terminal of Roc, residues 1511–1878), a serine/threonine protein kinase domain (residues 1879–2138), and a WD40 repeat-containing domain (residues 2142–2496). The most common pathogenic mutation lies within the catalytic domain (G2019S) and increases kinase activity, suggesting that LRRK2 inhibitors might offer therapeutic benefit for Parkinson's disease (Greggio et al, 2006; Ozelius et al, 2006; Smith et al, 2006; Jaleel et al, 2007; Hatcher et al, 2017). Members of the Rab GTPase family, including Rab8A, Rab10, and Rab29 (also known as RAB7L1), are substrates for LRRK2 (Steger et al, 2016). Recent work has defined a subset of 14 Rab proteins (Rab3A/B/C/D, Rab5A/B/C, Rab8A/B, Rab10, Rab12, Rab29, Rab35, and Rab43) that are potential direct substrates for LRRK2 (Steger et al, 2017). The LRRK2 phosphorylation site (Thr72 for Rab8A and Thr73 for Rab10) for all of these Rab proteins lies within the effector-binding, switch II motif (Pfeffer, 2001; Cherfils & Zeghouf, 2013). LRRK2 phosphorylation of Rab8A and Rab10 proteins blocks binding to Rab GDP-dissociation inhibitor (GDI) that is required for Rab protein membrane delivery and recycling; phosphorylation also inhibits binding of Rab8A to Rabin-8, its cognate guanine nucleotide exchange factor (GEF) (Steger et al, 2016, 2017). Pathogenic mutations located within the GTPase (R1441G/C) and COR (Y1699C) domains do not directly stimulate LRRK2 kinase activity in vitro (Jaleel et al, 2007; Nichols et al, 2010); nevertheless, they markedly enhance phosphorylation of Rab isoforms to an even greater extent than the G2019S mutation in vivo (Ito et al, 2016; Steger et al, 2016). These mutations promote GTP binding to the LRRK2 Roc domain (Guo et al, 2007; Lewis et al, 2007; Li et al, 2007; Daniels et al, 2011; Webber et al, 2011; Liao et al, 2014). One explanation for why the R1441G/C and Y1699C LRRK2 mutants are more active in cells is that enhanced GTP binding induces a conformational change, rendering LRRK2 more susceptible to activation by an as yet unknown, upstream activator. Rab29 is one of five genes contained within the PARK16 locus linked to Parkinson's disease (Simon-Sanchez et al, 2009; Tucci et al, 2010). It is most closely related to Rab32 and Rab38 GTPases that are needed for lysosome-related organelle biogenesis (Bultema & Di Pietro, 2013; Wang et al, 2014). In contrast to Rab29, Rab32 and Rab38 do not possess a LRRK2 phosphorylation site within their Switch II effector-binding motifs. There is significant variability within the PARK16 locus and Parkinson's association patterns across populations, and it is currently unclear how mutations within the PARK16 locus are linked to Parkinson's disease. Transcriptome analysis has suggested that the PARK16 locus enhances expression of Rab29 (Beilina et al, 2014). Other genetic studies of Parkinson's patient cohorts have found common variants within the LRRK2 and Rab29 genes that function coordinately to increase Parkinson's risk, as human genetic variants at these loci impact Parkinson's risk non-additively (MacLeod et al, 2013; Pihlstrom et al, 2015). A haplotype located near the 5′ region of RAB29 is associated with Parkinson's and epistasis between Rab29 and LRRK2 gene variants has been demonstrated (Pihlstrom et al, 2015). Genetic investigations in Caenorhabditis elegans neurons revealed that the RAB29 (GLO-1) orthologue acts upstream of LRRK2 (LRK-1) in a signaling pathway controlling axon termination (Kuwahara et al, 2016). It was also reported that Rab29 and LRRK2 double-knockout mice exhibit an enlarged kidney phenotype that was non-additive, relative to single Rab29 or LRRK2 knockout, further implying that these genes act in a common pathway (Kuwahara et al, 2016). Others have suggested that LRRK2 and various Rab proteins including Rab29 interact, largely based on co-immunoprecipitation analysis, but binding domains have not yet been pinpointed (Dodson et al, 2012; MacLeod et al, 2013; Beilina et al, 2014; Waschbusch et al, 2014; Zhang et al, 2015). It has also been reported that Rab29 recruits LRRK2 to the Golgi apparatus (MacLeod et al, 2013; Beilina et al, 2014). LRRK2 is constitutively phosphorylated at a cluster of Ser residues lying between the ankyrin domain and leucine-rich repeat region (Ser910, Ser935, Ser955 and Ser973) that plays a role in regulating 14-3-3 binding and cytosolic localization (Nichols et al, 2010; Doggett et al, 2011). These sites have received a lot of attention as they are controlled by LRRK2 kinase activity, and therefore become rapidly dephosphorylated in response to diverse LRRK2 inhibitors (Dzamko et al, 2010; Doggett et al, 2011). Monitoring the dephosphorylation of these residues, especially Ser935, has become the principal biomarker strategy to assess the in vivo efficacy of LRRK2 inhibitors (Hatcher et al, 2017). Despite a lot of research, it is currently unclear how LRRK2 kinase activity influences phosphorylation of these biomarker sites. Autophosphorylation would be the simplest model to account for the data obtained to date. However, autophosphorylation of the biomarker residues has not been observed in in vitro studies undertaken thus far, perhaps indicating a missing factor is required to stimulate autophosphorylation of these sites (Dzamko et al, 2010). Other kinases not known to be regulated by LRRK2 including CK1 (Chia et al, 2014) and PKA (Muda et al, 2014) have also been reported to phosphorylate these sites. In macrophages, the IkappaB kinase family phosphorylates Ser910 and Ser935 sites independently from LRRK2 kinase activity (Dzamko et al, 2012). In this study, we demonstrate that Rab29 functions as a critical upstream regulator of LRRK2 by stimulating kinase activity, inferred by assessing autophosphorylation of Ser1292 as well as phosphorylation of LRRK2 substrates such as Rab10. We find that the pathogenic LRRK2 mutants that bind GTP with higher affinity are activated by Rab29 to a much greater extent than wild-type LRRK2, suggesting a mechanism by which such mutations stimulate LRRK2 activity in vivo. Our studies suggest that LRRK2 interacts with Rab29 via its N-terminal ankyrin domain, and, strikingly, mutations that disrupt regulation by Rab29 prevent phosphorylation of a cluster of highly studied biomarker phosphorylation sites (Ser910, Ser935, Ser955 and Ser973) (Dzamko et al, 2010; Doggett et al, 2011). Our findings suggest that Rab29 plays a major role in regulating LRRK2 Golgi localization and kinase activity as well as potentially triggering phosphorylation of biomarker sites. Results Rab29 activates LRRK2 To explore whether Rab29 influences LRRK2 kinase activity, we co-expressed Rab29 with wild-type and pathogenic mutants of LRRK2 in HEK293 cells, and assessed LRRK2 autophosphorylation of Ser1292 (Sheng et al, 2012) as well as phosphorylation of endogenous Rab10 (Thr73) and Rab29 (Thr71), employing well-characterized phospho-specific antibodies (Fig EV1). Overexpression of Rab29 significantly enhanced both LRRK2 Ser1292 and Rab10 phosphorylation (Fig 1A). Rab29 stimulated activity of the "enhanced GTP-binding mutants" (R1441C, R1441G, R1441H, Y1699C) to a much greater extent than wild-type LRRK2 (Fig 1A). Rab29 was also phosphorylated by the R1441G/C and Y1699C mutants to a much greater extent than wild-type LRRK2, consistent with the higher activation state of these pathogenic mutants (Fig 1A). Due to its higher basal activity, the G2019S mutant displayed elevated kinase activity in the absence of Rab29 overexpression, which was further enhanced upon Rab29 overexpression. The I2020T, T2031S, and G2385R pathogenic mutants behaved more like wild-type LRRK2 and were activated by Rab29 overexpression to a lesser extent than the enhanced GTP-binding mutants (Fig 1A). In general, the amount of Rab10 phosphorylation correlates with the extent of LRRK2 activation; however, some variation correlating with the level of Rab29 expression is observed. Furthermore, there are 14 Rab proteins that are phosphorylated by LRRK2 (Steger et al, 2017) and conceivably, LRRK2 mutants may have slightly different localization or preferences for diverse Rab proteins, which could also account for variation between Ser1292 phosphorylation and Rab10 phosphorylation observed (Fig 1A). We also found that stimulation of Ser1292 as well as Rab10 phosphorylation induced by overexpression of Rab29 was abolished by introducing a kinase-inactivating D2017A mutation (Fig 1A, right panels), confirming that Rab29 was enhancing phosphorylation by stimulating LRRK2 kinase activity. Click here to expand this figure. Figure EV1. Specificity of phospho-antibodies HEK293 cells were transfected with LRRK2[G2091S] or LRRK2[S1292A, G2019S]. 24 h post-transfection, cells were treated in the presence (+) or absence (−) of the LRRK2 inhibitor MLi-2 (100 nM, 60 min) lysed and analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. As in (A) except that the indicated HA-tagged Rab isoforms were co-expressed with LRRK2[Y1699C] in HEK293 cells to maximally phosphorylate these isoforms. Lysates were subjected to immunoblotting with an anti-Rab29 phospho Thr71 antibody. Same as (B) except for immunoblotting with an anti-Rab10 phospho Thr73 antibody. No signal is detected upon treatment with MLi-2 or mutation of Rab29 or Rab10 phospho-residue to an alanine. WT, wild type. Download figure Download PowerPoint Figure 1. Rab29 activates LRRK2 Left: HEK293 cells were transfected with the indicated wild-type and human full-length pathogenic LRRK2 variants with either HA-empty vector (−) or HA-tagged Rab29 (+). 24 h post-transfection, cells were lysed and analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. WT is wild-type and D2017A corresponds to the kinase-inactive LRRK2 mutant. Similar results were obtained in two separate experiments. Right: As in left panel except that kinase-inactivating D2017A LRRK2 mutation was inserted into the indicated LRRK2 pathogenic mutant. Similar results were obtained in two independent experiments. As in (A) except that LRRK2[R1441G] pathogenic variant was co-transfected with wild-type and indicated mutants of Rab29. EE indicates Rab29[T71E,S72E] mutation and AA indicates Rab29[T71A,S72A] mutation. Similar results were obtained in two separate experiments, each performed in duplicate. Download figure Download PowerPoint To test whether phosphorylation of Rab29 at Thr71 and Ser72 by LRRK2 was required for activation of LRRK2, we mutated these sites both to Ala. We found that the Rab29[T71A,S72A] mutant still activated LRRK2[R1441G] to the same extent as wild-type Rab29, indicating that phosphorylation of Rab29 is not required for its ability to activate LRRK2 (Fig 1B). In an attempt to mimic phosphorylation of Rab29 by LRRK2, we mutated the phosphorylation sites to Glu and observed that the Rab29[T71E,S72E] mutant failed to activate LRRK2 (Fig 1B). This suggests that Rab29 phosphorylation may decrease its ability to activate LRRK2. Rab29 selectively activates LRRK2 We next evaluated the effect that 11 Rab proteins including Rab32 and Rab38 (that are highly related to Rab29) have on Ser1292 phosphorylation of wild-type LRRK2 (Fig EV2A) and LRRK2[R1441G] (Fig EV2B). We found that for wild-type LRRK2, Rab29 markedly stimulated Ser1292 phosphorylation, but with exception of Rab12, which induced a modest ~twofold increase, none of the other Rab proteins including Rab32 and Rab38 activated LRRK2 significantly (Fig EV2A). For the LRRK2[R1441G] mutant, Rab29 also markedly increased Ser1292 phosphorylation more than any of the other Rab proteins (Fig EV2B), but Rab8A and Rab38 also stimulated Ser1292 phosphorylation two- to threefold (Fig EV2B). Click here to expand this figure. Figure EV2. Rab29 selectively activates LRRK2 A, B. HEK293 cells were transfected with the wild-type LRRK2 (A) or LRRK2[R1441G] (B) with either HA-empty vector (−) or the indicated HA-tagged Rab proteins. 24 h post-transfection, cells were lysed and analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. Blots were quantified by LiCor and presented as average ± SEM, and analyzed using one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test comparing all groups to the HA-empty vector (−). For (A) WT LRRK2, there was a statistically significant difference between groups (P = 0.0135, one-way ANOVA, F(11, 12) = 3.911). nsP > 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test with mean difference 95% confidence intervals of groups compared to HA-empty vector control: Rab1B −356.9 to 332.6; Rab5B −342.0 to 347.6; Rab7A −332.4 to 357.2; Rab8A −378.6 to 311.0; Rab8B −346.7 to 342.9; Rab10 −372.3 to 317.3; Rab12 −499.8 to 189.8; Rab29 −865.3 to −175.7; Rab32 −372.7 to 316.8; Rab38 −367.4 to 322.2; Rab39B −346.5 to 343.1. For (B) LRRK2[R1441G], there was also a statistically significant difference between groups (P = 0.0007, one-way ANOVA, F(11, 12) = 7.642). nsP > 0.05, ***P < 0.001 by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test with mean difference 95% confidence intervals of groups compared to HA-empty vector control: Rab1B −386.5 to 411.2; Rab5B −410.2 to 387.5; Rab7A −377.0 to 420.7; Rab8A −668.2 to 129.6; Rab8B −517.5 to 280.3; Rab10 −421.1 to 376.7; Rab12 −503.2 to 294.6; Rab29 −1,243 to −445.7; Rab32 −433.5 to 364.3; Rab38 −548.2 to 249.5; Rab39B −390.4 to 407.4. Results were obtained in two separate experiments, each performed in duplicate. Download figure Download PowerPoint Rab29 activates LRRK2 on Golgi membranes At steady state, LRRK2 is primarily cytosolic; approximately 10% associates with membranes upon cell fractionation. The large pool of cytoplasmic protein obscures the localization of the membrane-associated pool in fixed cells. To overcome this challenge, and to avoid the possibility of spurious precipitation of cytosolic LRRK2 protein onto cellular structures during fixation, we employed an established liquid nitrogen coverslip freeze–thaw protocol (Seaman, 2004) to deplete cytosolic proteins and reveal the localization of membrane-associated LRRK2 protein. Figure 2 shows the localization of R1441G LRRK2 in HeLa cells upon transient transfection. The protein is localized predominantly in the perinuclear region but distinct, peripheral punctae are also detected, and 60% of these also contain Rab10 protein (Fig 2A and C). In the perinuclear region, more than 40% of the LRRK2 punctae co-localized with Rab8 protein (Fig 2B and D). These findings are consistent with the fact that Rab10 and Rab8 are significant LRRK2 substrates (Steger et al, 2016). Figure 2. R1441G-LRRK2 co-localizes with Rab10 in the periphery and Rab8 near the nucleus A, B. Shown are HeLa cells stained for transfected R1441G-LRRK2 (red) and either GFP-Rab10 (A) or GFP-Rab8 (B) in green. Scale bar, 10 μm. The second row in both panels shows enlarged portions boxed in the rows above. Scale bar, 2 μm. C, D. Percent co-localization of R1441G-LRRK2 with the indicated Rab in the indicated cell regions was determined from a Mander's coefficient after automatic thresholding. Error bars represent mean ± SEM. ****P < 0.0001; **P = 0.0076 by Student's unpaired, two-tailed t-test (n = 13 from two experiments). For peripheral quantitation, boxes of the size indicated were generated (see A) that included the plasma membrane and excluded the nucleus. For perinuclear quantitation (see B), the boxes included half of the nucleus. Download figure Download PowerPoint Rab29 is localized to the Golgi complex (Wang et al, 2014) where it overlaps with p115 protein (Fig 3A). Like LRRK2 R1441G (Fig 2), LRRK2 G2019S also displays a distributed, punctate pattern when expressed on its own (Fig 3E). A small amount of perinuclear LRRK2 may co-localize with endogenous Rab29, but available antibodies were unable to label endogenous Rab29 protein. However, when LRRK2 G2019S was co-expressed in cells with Rab29, the proteins showed significant co-localization over an extended, somewhat perinuclear, reticular structure (Fig 3B). This structure is likely to represent a disrupted Golgi complex, as staining became much more concentrated in the perinuclear region upon treatment of cells with the MLI-2 LRRK2 kinase inhibitor (Fig 3C and D). Co-localization of LRRK2 G2019S (Fig 3B) and R1441G proteins (see Fig 7H below) with Rab29 supports a model in which Rab29 can activate pathogenic LRRK2 proteins on Rab29-containing membranes. Figure 3. Pathogenic LRRK2 mutants co-localize with Rab29 and disperse Golgi membranesHeLa cells were transfected with LRRK2-G2019S or Myc-Rab29 or LRRK2-G2019S and 24 h later transfected with Myc-Rab29. After 48 h, cells were permeabilized by liquid nitrogen freeze–thaw to deplete cytosol and then fixed and stained with mouse anti-p115, mouse anti-Myc, and rabbit anti-GFP or rabbit anti-LRRK2 antibodies. Myc-Rab29 (green) and p115 (red) show co-localization at the Golgi. Left and right panels were treated with or without MLI2 (200 nM, 4 h) as indicated. Myc-Rab29 (red) and eGFP-LRRK2-G2019S (green) show co-localization and dispersed Rab29-labeled Golgi membranes. Cells treated with MLI-2 (200 nM, 4 h) show compact, Rab29-positive Golgi, and associated LRRK2-G2019S (green). Percent of cells with compact Rab29 staining; ***P = 0.0002; **P = 0.002 with Student's unpaired, two-tailed t-test. Error bars represent SEM for three experiments with > 30 cells per condition in each experiment. LRRK2-G2019S alone showing punctate staining throughout the cell. Data information: Scale bars, 10 μm. Download figure Download PowerPoint Disruption of the Golgi by pathogenic LRRK2 proteins has been previously reported (MacLeod et al, 2013; Beilina et al, 2014), and light microscopic analysis of the trans-Golgi network in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) (as monitored using anti-GCC185 antibodies) confirmed this finding (Fig 4A and C); MLI2 treatment restored compact Golgi localization for GCC185-stained compartments (compare Fig 4B and C right and left panels). Note that the extent of Golgi fragmentation correlated with the relative kinase activation of the LRRK2 mutant proteins. Together, these data show that LRRK2 co-localizes with its substrates, Rab10 and Rab8, and also co-localizes with an important key activator, Rab29 GTPase. Figure 4. LRRK2-R1441G expression disrupts Golgi morphology Wild-type MEFs were stained with rabbit anti-GCC185 (green) and DAPI (blue); left and right panels were treated with or without MLI2 as indicated. Knock-in R1441G MEF cells ± MLI-2 (200 nM, 4 h) stained with rabbit anti-GCC185 antibody (green) and DAPI (blue). Quantitation of the percent of cells showing a compact trans-Golgi network as seen in (A). Error bars represent SEM from two experiments with > 50 cells per condition in each experiment. *P = 0.0184 with Student's unpaired, two-tailed t-test. Differences between WT, WT+MLI2, and R1441G+MLI2 were not significant (P > 0.5). Data information: Scale bars, 10 μm. Download figure Download PowerPoint Rab29 activation of LRRK2 would be predicted to occur on membrane surfaces harboring active Rab29 protein. To test this, cells expressing Rab29 and R1441G LRRK2 were fractionated into membrane and cytosol fractions and analyzed for their content of total and activated LRRK2 protein, using anti-LRRK2 and anti-pS1292 antibodies. Expression of Rab29 increased the amount of total membrane-associated LRRK2 (Fig 5A and B) and also led to a greater than threefold enrichment of activated, pS1292 LRRK2 on membranes (Fig 5C). Similar data were obtained for G2019S-LRRK2 (see Fig 7 below). Note that about 10% of LRRK2-R1441G is also detected in membrane fractions obtained from Rab29 knockout 293 T cells (Fig 5B). This Rab29-independent pool may represent association of LRRK2 with another Rab GTPase such as Rab8A or Rab38, or could represent R1441G LRRK2 aggregates. Figure 5. Rab29 increases membrane association of LRRK2-R1441GHEK293T Rab29−/− (KO) and WT cells were transfected with LRRK2-R1441G and 24 h later transfected with Myc-Rab29. After 48 h, cells were harvested and fractionated into cytosol and membrane fractions. Immunoblot of membrane protein (75 μg) and the 50% of equivalent volume of cytosolic proteins, ±Rab29 as indicated. Numbers at left indicate mobility of marker proteins in kDa; proteins were detected with rabbit anti-pS1292, rabbit anti-LRRK2 UDD3, mouse anti-LRRK2, mouse anti-LAMP2, mouse anti-tubulin, and mouse anti-Myc antibodies. Quantitation of the fraction of total LRRK2-R1441G on membranes ± Rab29 (transfected and endogenous). Amount of active (pS1292) LRRK2 in membrane and cytosol fractions ± Rab29 expression normalized to the amount of total LRRK2 in the fraction. Data information: Error bars represent SEM from two experiments. **P = 0.0025; ****P = 0.00013; ns = not significant (P = 0.1968) by Student's unpaired, two-tailed t-test. Differences between Rab29 KO and (minus) Myc-Rab29 are not significant. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 5 [embj201798099-sup-0002-SDataFig5.pdf] Download figure Download PowerPoint Ankyrin domain residues permit activation of LRRK2 by Rab29 In an initial attempt to define the region of LRRK2 required for Rab29 activation, we generated a truncation mutant of LRRK2 lacking the N-terminal, 969 non-catalytic residues encompassing the armadillo and ankyrin domains. Although this mutant is expressed at lower levels than full-length LRRK2 in HEK293 cells, it was clearly not activated by Rab29 overexpression (Fig 6A), indicating that the Rab29 effector region lies within the LRRK2 N-terminal fragment, which was also suggested in a previous study (Beilina et al, 2014). Figure 6. Ankyrin domain residues permit activation of LRRK2 by Rab

Parkinson's disease-associated LRRK2 kinase phosphorylates multiple Rab GTPases, including Rab8A and Rab10. We show here that LRRK2 kinase interferes with primary cilia formation in cultured cells, human LRRK2 G2019S iPS cells and in the cortex of LRRK2 R1441C mice. Rab10 phosphorylation strengthens its intrinsic ability to block ciliogenesis by enhancing binding to RILPL1. Importantly, the ability of LRRK2 to interfere with ciliogenesis requires both Rab10 and RILPL1 proteins. Pathogenic LRRK2 influences the ability of cells to respond to cilia-dependent, Hedgehog signaling as monitored by Gli1 transcriptional activation. Moreover, cholinergic neurons in the striatum of LRRK2 R1441C mice show decreased ciliation, which will decrease their ability to sense Sonic hedgehog in a neuro-protective circuit that supports dopaminergic neurons. These data reveal a molecular pathway for regulating cilia function that likely contributes to Parkinson's disease-specific pathology.

ABSTRACT Mutations that activate LRRK2 protein kinase cause Parkinson’s disease. We have shown previously that Rab10 phosphorylation by LRRK2 enhances its binding to RILPL1 and together, these proteins block cilia formation in a variety of cell types including patient derived iPS cells. We have used live cell fluorescence microscopy to identify, more precisely, the effect of LRRK2 kinase activity on both the formation of cilia triggered by serum starvation and loss of cilia seen upon serum re-addition. LRRK2 activity decreases the overall probability of ciliation without changing the rates of cilia formation in R1441C LRRK2 MEF cells. Cilia loss in these cells is accompanied by ciliary decapitation. Kinase activity does not change the timing or frequency of decapitation or the rate of cilia loss, but increases the percent of cilia that are lost upon serum addition. LRRK2 activity, or overexpression of RILPL1 protein, blocks release of CP110 from the mother centriole, a step normally required for early ciliogenesis. In both cases, failure of CP110 uncapping was due to failure to recruit TTBK2, a kinase needed for CP110 release. In contrast, recruitment of EHD1, another step important for ciliogenesis, appears unaltered. These experiments provide critical detail to our understanding of the cellular consequences of pathogenic LRRK2 mutation, and indicate that LRRK2 blocks ciliogenesis upstream of TTBK2 and enhances the deciliation process in response to serum addition. SIGNIFICANCE STATEMENT Mutations that activate LRRK2 protein kinase cause Parkinson’s disease. LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases, in particular Rab8 and Rab10. Phosphorylated Rabs bind preferentially to a distinct set of effectors and block in primary ciliation in multiple cell types. We show here that the cilia blockade is upstream of the recruitment of TTBK2 kinase to the mother centriole, a step required for the release of CP110 and subsequent cilia formation. This study provides fundamental information related to how pathogenic LRRK2 interferes with normal cell physiology.

Abstract Activating mutations in the Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) cause Parkinson’s disease and previously we showed that activated LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases (Steger et al., 2017). Moreover, Golgi-associated Rab29 can recruit LRRK2 to the surface of the Golgi and activate it there for both auto- and Rab substrate phosphorylation. Here we define the precise Rab29 binding region of the LRRK2 Armadillo domain between residues 360-450 and show that this domain, termed “Site #1”, can also bind additional LRRK2 substrates, Rab8A and Rab10. Moreover, we identify a distinct, N-terminal, higher affinity interaction interface between LRRK2 phosphorylated Rab8 and Rab10 termed “Site #2”, that can retain LRRK2 on membranes in cells to catalyze multiple, subsequent phosphorylation events. Kinase inhibitor washout experiments demonstrate that rapid recovery of kinase activity in cells depends on the ability of LRRK2 to associate with phosphorylated Rab proteins, and phosphorylated Rab8A stimulates LRRK2 phosphorylation of Rab10 in vitro. Reconstitution of purified LRRK2 recruitment onto planar lipid bilayers decorated with Rab10 protein demonstrates cooperative association of only active LRRK2 with phospho-Rab10-containing membrane surfaces. These experiments reveal a feed-forward pathway that provides spatial control and membrane activation of LRRK2 kinase activity.

Abstract Previously, we showed that cholinergic interneurons of the dorsal striatum lose cilia in mice harboring the Parkinson’s disease associated, kinase activating, R1441C LRRK2 mutation (Dhekne et al., 2018). Here we show that this phenotype is also seen in two mouse strains carrying the most common human G2019S LRRK2 mutation. Heterozygous loss of the PPM1H phosphatase that is specific for LRRK2-phosphorylated Rab GTPases (Berndsen et al., 2019) yields the same cilia loss phenotype, strongly supporting a connection between Rab GTPase phosphorylation and cilia loss. In addition, astrocytes throughout the striatum show a ciliation defect in LRRK2 and PPM1H -/+ mutant models. Hedgehog signaling requires cilia, and loss of cilia correlates here with a loss in induction of Hedgehog signaling as monitored by in situ hybridization of Gli1 transcripts. These data support a model in which LRRK2 and PPM1H mutant mice struggle to receive and respond to critical Hedgehog signals in the nigral-striatal pathway.

ABSTRACT PPM1H phosphatase reverses Parkinson’s disease-associated, LRRK2-mediated Rab GTPase phosphorylation. We show here that PPM1H relies on an N-terminal amphipathic helix for Golgi localization. The amphipathic helix enables PPM1H to bind to liposomes in vitro, and small, highly curved liposomes stimulate PPM1H activity. We artificially anchored PPM1H to the Golgi, mitochondria, or mother centriole. Our data show that regulation of Rab10 GTPase phosphorylation requires PPM1H access to Rab10 at or near the mother centriole. Moreover, poor co-localization of Rab12 explains in part why it is a poor substrate for PPM1H in cells but not in vitro. These data support a model in which localization drives PPM1H substrate selection and centriolar PPM1H is critical for regulation of Rab GTPase-regulated ciliogenesis. Moreover, Golgi localized PPM1H maintains active Rab GTPases on the Golgi to carry out their non-ciliogenesis-related functions in membrane trafficking. Significance Statement Pathogenic, hyperactive LRRK2 kinase is strongly linked to Parkinson’s disease and LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases that are master regulators of membrane trafficking. PPM1H phosphatase specifically dephosphorylates Rab8A and Rab10, the major LRRK2 substrates. Here we provide novel cell biological and biochemical insight related to the localization and activation of PPM1H phosphatase. Understanding how PPM1H modulates LRRK2 activity is of fundamental interest and also important, as activators of PPM1H may eventually benefit Parkinson’s disease patients.

Abstract Activating mutations in the Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) cause Parkinson’s disease. LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases, particularly Rab10 and Rab8A, and we showed previously that phosphoRabs play an important role in LRRK2 membrane recruitment and activation (Vides et al., 2022). To learn more about LRRK2 pathway regulation, we carried out an unbiased, CRISPR-based genome-wide screen to identify modifiers of cellular phosphoRab10 levels. A flow cytometry assay was developed to detect changes in phosphoRab10 levels in pools of mouse NIH-3T3 cells harboring unique CRISPR guide sequences. Multiple negative and positive regulators were identified; surprisingly, knockout of the Rab12 gene was especially effective in decreasing phosphoRab10 levels in multiple cell types and knockout mouse tissues. Rab-driven increases in phosphoRab10 were specific for Rab12, LRRK2 dependent and PPM1H phosphatase reversible; they were seen with wild type and pathogenic G2019S and R1441C LRRK2. AlphaFold modeling revealed a novel Rab12 binding site in the LRRK2 Armadillo domain and we show that residues predicted to be essential for Rab12 interaction at this site influence overall phosphoRab levels in a manner distinct from Rab29 activation of LRRK2. Our data support a model in which Rab12 binding to a new site in the LRRK2 Armadillo domain activates LRRK2 kinase for Rab phosphorylation and could serve as a new therapeutic target for a novel class of LRRK2 inhibitors that do not target the kinase domain.

Abstract Activating mutations in LRRK2 kinase cause Parkinson’s disease. Pathogenic LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases and blocks ciliogenesis. Thus, defining novel phospho-Rab interacting partners is critical to our understanding of the molecular basis of LRRK2 pathogenesis. RILPL2 binds with strong preference to LRRK2-phosphorylated Rab8A and Rab10. RILPL2 is a binding partner of the motor protein and Rab effector, Myosin Va. We show here that the globular tail domain of Myosin Va also contains a high affinity binding site for LRRK2-phosphorylated Rab10, and certain tissue-specific Myosin Va isoforms strongly prefer to bind phosphorylated Rab10. In the presence of pathogenic LRRK2, RILPL2 relocalizes to the peri-centriolar region in a phosphoRab10- and Myosin Va-dependent manner. In the absence of phosphoRab10, expression of RILPL2 or depletion of Myosin Va increase centriolar RILPL2 levels, and either condition is sufficient to block ciliogenesis in RPE cells. These experiments show that LRRK2 generated phosphoRab10 dramatically redistributes Myosin Va-RILPL2 complexes to the mother centriole, which may sequester Myosin Va and RILPL2 in a manner that blocks their normal roles in ciliogenesis.