INTRODUCTION Almost all archaea and about half of bacteria possess clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)–CRISPR-associated genes (Cas) adaptive immune systems, which protect microbes against viruses and other foreign DNA. All functionally characterized CRISPR systems have been reported to target DNA, with some multicomponent type III systems also targeting RNA. The putative class 2 type VI system, which has not been functionally characterized, encompasses the single-effector protein C2c2, which contains two Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding (HEPN) domains commonly associated with ribonucleases (RNases), suggesting RNA-guided RNA-targeting function. RATIONALE Existing studies have only established a role for RNA interference, in addition to DNA interference, in the multicomponent type III-A and III-B systems. We investigated the possibility of C2c2-mediated RNA inference by heterologously expressing C2c2 locus from Leptotrichia shahii (LshC2c2) in the model system Escherichia coli. The ability of LshC2c2 to protect against MS2 single-stranded RNA (ssRNA) phage infection was assessed by using every possible spacer sequence against the phage genome. We next developed protocols to reconstitute purified recombinant LshC2c2 protein and test its biochemical activity when incubated with its mature CRISPR RNA (crRNA) and target ssRNA. We systematically evaluated the parameters necessary for cleavage. Last, to demonstrate the potential utility of the LshC2c2 complex for RNA targeting in living bacterial cells, we guided it to knockdown red fluorescent protein (RFP) mRNA in vivo. RESULTS This work demonstrates the RNA-guided RNase activity of the putative type VI CRISPR-effector LshC2c2. Heterologously expressed C2c2 can protect E. coli from MS2 phage, and by screening against the MS2 genome, we identified a H (non-G) protospacer flanking site (PFS) following the RNA target site, which was confirmed by targeting a complementary sequence in the β-lactamase transcript followed by a degenerate nucleotide sequence. Using purified LshC2c2 protein, we demonstrate that C2c2 and crRNA are sufficient in vitro to achieve RNA-guided, PFS-dependent RNA cleavage. This cleavage preferentially occurs at uracil residues in ssRNA regions and depends on conserved catalytic residues in the two HEPN domains. Mutation of these residues yields a catalytically inactive RNA-binding protein. The secondary structure of the crRNA direct repeat (DR) stem is required for LshC2c2 activity, and mutations in the 3′ region of the DR eliminate cleavage activity. Targeting is also sensitive to multiple or consecutive mismatches in the spacer:protospacer duplex. C2c2 targeting of RFP mRNA in vivo results in reduced fluorescence. The knockdown of the RFP mRNA by C2c2 slowed E. coli growth, and in agreement with this finding, in vitro cleavage of the target RNA results in “collateral,” nonspecific cleavage of other RNAs present in the reaction mix. CONCLUSION LshC2c2 is a RNA-guided RNase which requires the activity of its two HEPN domains, suggesting previously unidentified mechanisms of RNA targeting and degradation by CRISPR systems. Promiscuous RNase activity of C2c2 after activation by the target slows bacterial growth and suggests that C2c2 could protect bacteria from virus spread via programmed cell death and dormancy induction. A single-effector RNA targeting system has the potential to serve as a general chassis for molecular tools for visualizing, degrading, or binding RNA in a programmable, multiplexed fashion. C2c2 is an RNA-guided RNase that provides protection against RNA phage. CRISPR-C2c2 from L. shahii can be reconstituted in E. coli to mediate RNA-guided interference of the RNA phage MS2. Biochemical characterization of C2c2 reveals crRNA-guided RNA cleavage facilitated by the two HEPN nuclease domains. Binding of the target RNA by C2c2-crRNA also activates a nonspecific RNase activity, which may lead to promiscuous cleavage of RNAs without complementarity to the crRNA guide sequence.

Microbial CRISPR-Cas systems are divided into Class 1, with multisubunit effector complexes, and Class 2, with single protein effectors. Currently, only two Class 2 effectors, Cas9 and Cpf1, are known. We describe here three distinct Class 2 CRISPR-Cas systems. The effectors of two of the identified systems, C2c1 and C2c3, contain RuvC-like endonuclease domains distantly related to Cpf1. The third system, C2c2, contains an effector with two predicted HEPN RNase domains. Whereas production of mature CRISPR RNA (crRNA) by C2c1 depends on tracrRNA, C2c2 crRNA maturation is tracrRNA independent. We found that C2c1 systems can mediate DNA interference in a 5′-PAM-dependent fashion analogous to Cpf1. However, unlike Cpf1, which is a single-RNA-guided nuclease, C2c1 depends on both crRNA and tracrRNA for DNA cleavage. Finally, comparative analysis indicates that Class 2 CRISPR-Cas systems evolved on multiple occasions through recombination of Class 1 adaptation modules with effector proteins acquired from distinct mobile elements.

Abstract

 The X-ray crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase reveals a "crab claw"–shaped molecule with a 27 Å wide internal channel. Located on the back wall of the channel is a Mg²⁺ ion required for catalytic activity, which is chelated by an absolutely conserved motif from all bacterial and eukaryotic cellular RNA polymerases. The structure places key functional sites, defined by mutational and cross-linking analysis, on the inner walls of the channel in close proximity to the active center Mg²⁺. Further out from the catalytic center, structural features are found that may be involved in maintaining the melted transcription bubble, clamping onto the RNA product and/or DNA template to assure processivity, and delivering nucleotide substrates to the active center.

Targeting of multiple genomic loci with Cas9 is limited by the need for multiple or large expression constructs. Here we show that the ability of Cpf1 to process its own CRISPR RNA (crRNA) can be used to simplify multiplexed genome editing. Using a single customized CRISPR array, we edit up to four genes in mammalian cells and three in the mouse brain, simultaneously.

A DNA sequence rich in (A+T), located upstream of the -10, -35 region of the Escherichia coli ribosomal RNA promoter rrnB P1 and called the UP element, stimulates transcription by a factor of 30 in vivo, as well as in vitro in the absence of protein factors other than RNA polymerase (RNAP). When fused to other promoters, such as lacUV5, the UP element also stimulates transcription, indicating that it is a separable promoter module. Mutations in the carboxyl-terminal region of the α subunit of RNAP prevent stimulation of these promoters by the UP element although the mutant enzymes are effective in transcribing the "core" promoters (those lacking the UP element). Protection of UP element DNA by the mutant RNAPs is severely reduced in footprinting experiments, suggesting that the selective decrease in transcription might result from defective interactions between α and the UP element. Purified α binds specifically to the UP element, confirming that α acts directly in promoter recognition. Transcription of three other promoters was also reduced by the COOH-terminal α mutations. These results suggest that UP elements comprise a third promoter recognition region (in addition to the -10, -35 recognition hexamers, which interact with the σ subunit) and may account for the presence of (A+T)-rich DNA upstream of many prokaryotic promoters. Since the same α mutations also block activation by some transcription factors, mechanisms of promoter stimulation by upstream DNA elements and positive control by certain transcription factors may be related.

Prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas (CRISPR-associated sequences) systems provide adaptive immunity against viruses when a spacer sequence of small CRISPR RNA (crRNA) matches a protospacer sequence in the viral genome. Viruses that escape CRISPR/Cas resistance carry point mutations in protospacers, though not all protospacer mutations lead to escape. Here, we show that in the case of Escherichia coli subtype CRISPR/Cas system, the requirements for crRNA matching are strict only for a seven-nucleotide seed region of a protospacer immediately following the essential protospacer-adjacent motif. Mutations in the seed region abolish CRISPR/Cas mediated immunity by reducing the binding affinity of the crRNA-guided Cascade complex to protospacer DNA. We propose that the crRNA seed sequence plays a role in the initial scanning of invader DNA for a match, before base pairing of the full-length spacer occurs, which may enhance the protospacer locating efficiency of the E. coli Cascade complex. In agreement with this proposal, single or multiple mutations within the protospacer but outside the seed region do not lead to escape. The relaxed specificity of the CRISPR/Cas system limits escape possibilities and allows a single crRNA to effectively target numerous related viruses.

CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated genes) is a small RNA-based adaptive prokaryotic immunity system that functions by acquisition of short fragments of DNA (mainly from foreign invaders such as viruses and plasmids) and subsequent destruction of DNA with sequences matching acquired fragments. Some mutations in foreign DNA that affect the match prevent CRISPR/Cas defensive function. Here we show that matching sequences that are no longer able to elicit defense, still guide the CRISPR/Cas acquisition machinery to foreign DNA, thus making the spacer acquisition process adaptive and leading to restoration of CRISPR/Cas-mediated protection. We present evidence suggesting that after initial recognition of partially matching foreign DNA, the CRISPR/Cas acquisition machinery moves along the DNA molecule, occasionally selecting fragments to be incorporated into the CRISPR locus. Our results explain how adaptive CRISPR/Cas immunity becomes specifically directed towards foreign DNA, allowing bacteria to efficiently counter individual viral mutants that avoid CRISPR/Cas defense. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system protects prokaryotes from foreign DNA. Here, bacteriophage DNA containing mutations that can circumvent this response are shown to be incorporated into the CRISPR locus, allowing bacteria to remember previous infections in an adaptive manner.

The prokaryotic CRISPR/Cas immune system is based on genomic loci that contain incorporated sequence tags from viruses and plasmids. Using small guide RNA molecules, these sequences act as a memory to reject returning invaders. Both the Cascade ribonucleoprotein complex and the Cas3 nuclease/helicase are required for CRISPR interference in Escherichia coli, but it is unknown how natural target DNA molecules are recognized and neutralized by their combined action. Here we show that Cascade efficiently locates target sequences in negatively supercoiled DNA, but only if these are flanked by a protospacer-adjacent motif (PAM). PAM recognition by Cascade exclusively involves the crRNA-complementary DNA strand. After Cascade-mediated R loop formation, the Cse1 subunit recruits Cas3, which catalyzes nicking of target DNA through its HD-nuclease domain. The target is then progressively unwound and cleaved by the joint ATP-dependent helicase activity and Mg2+-dependent HD-nuclease activity of Cas3, leading to complete target DNA degradation and invader neutralization.

Meghan M. Sharp, Cathleen L. Chan, Chi Zen Lu, Michael T. Marr, Sergei Nechaev, Ernest W. Merritt, Konstantin Severinov, Jeffrey W. Roberts, and Carol A. Gross University of California, San Francisco, San Francisco, California 94143 USA; Section of Biochemistry, Molecular and Cell Biology, Cornell University, Ithaca, New York 14853 USA; Department of Genetics, Waksman Institute, Rutgers, The State University of New Jersey, Piscataway, New Jersey 08854 USA; Proctor and Gamble Pharmaceuticals, Health Care Research Center, Mason, Ohio 45040 USA

Type VI CRISPR-Cas systems are the only CRISPR variety that cleaves exclusively RNA 1,2 . In addition to the CRISPR RNA (crRNA)-guided, sequence-specific binding and cleavage of target RNAs, such as phage transcripts, the type VI effector, Cas13, causes collateral RNA cleavage, which induces bacterial cell dormancy, thus protecting the host population from phage spread 3,4 . We show here that the principal form of collateral RNA degradation elicited by Cas13a protein from Leptotrichia shahii upon target RNA recognition is the cleavage of anticodons of multiple tRNA species, primarily those with anticodons containing uridines. This tRNA cleavage is necessary and sufficient for bacterial dormancy induction by Cas13a. In addition, Cas13a activates the RNases of bacterial toxin-antitoxin modules, thus indirectly causing mRNA and rRNA cleavage, which could provide a back-up defense mechanism. The identified mode of action of Cas13a resembles that of bacterial anticodon nucleases involved in antiphage defense 5 , which is compatible with the hypothesis that type VI effectors evolved from an abortive infection module 6,7 encompassing an anticodon nuclease.