Abstract Cis -regulatory elements (CREs) are critical in regulating gene expression, and yet our understanding of CRE evolution remains a challenge. Here, we constructed a comprehensive single-cell atlas of chromatin accessibility in Oryza sativa , integrating data from 104,029 nuclei representing 128 discrete cell states across nine distinct organs. We used comparative genomics to compare cell-type resolved chromatin accessibility between O. sativa and 57,552 nuclei from four additional grass species ( Zea mays, Sorghum bicolor, Panicum miliaceum , and Urochloa fusca ). Accessible chromatin regions (ACRs) had different levels of conservation depending on the degree of cell-type specificity. We found a complex relationship between ACRs with conserved noncoding sequences, cell-type specificity, conservation, and tissue-specific switching. Additionally, we found that epidermal ACRs were less conserved compared to other cell types, potentially indicating that more rapid regulatory evolution has occurred in the L1 epidermal layer of these species. Finally, we identified and characterized a conserved subset of ACRs that overlapped the repressive histone modification H3K27me3, implicating them as potentially critical silencer CREs maintained by evolution. Collectively, this comparative genomics approach highlights the dynamics of cell-type-specific CRE evolution in plants.

While considerable knowledge exists about the enzymes pivotal for C4 photosynthesis, much less is known about cis-regulation important for specifying their expression in distinct cell types. Here, we use single-cell-indexed ATAC-seq to identify cell-type-specific accessible chromatin regions (ACRs) associated with C4 enzymes for five different grass species. This study spans four C4 species, covering three distinct photosynthetic subtypes: Zea mays and Sorghum bicolor (NADP-ME), Panicum miliaceum (NAD-ME), Urochloa fusca (PEPCK), along with the C3 outgroup Oryza sativa. We studied the cis-regulatory landscape of enzymes essential across all C4 species and those unique to C4 subtypes, measuring cell-type-specific biases for C4 enzymes using chromatin accessibility data. Integrating these data with phylogenetic trees revealed diverse co-option of gene family members between species, showcasing the various paths of C4 evolution. We mapped cell-type-specific ACRs surrounding each C4 gene, discovering that, on average, these genes have two to three cell-type-specific ACRs located beyond the core promoter. These results provide a detailed genomic map of potential regulatory sequences operating on key C4 genes. Examining the evolutionary history of these cell-type-specific ACRs revealed a spectrum of conserved and novel ACRs, even among closely related species, indicating ongoing evolution of cis-regulation at these C4 loci. This work illuminates the dynamic and complex nature of CRE evolution in C4 photosynthesis, particularly highlighting the intricate cis-regulatory evolution of key loci. Our findings offer a valuable resource for future investigations, potentially aiding in the optimization of C3 crop performance under changing climatic conditions.

Gene expression and complex phenotypes are determined by the activity of cis -regulatory elements. However, an understanding of how extant genetic variants affect cis -regulatory activity remains limited. Here, we investigated the consequences of cis-regulatory diversity using single-cell genomics of >0.7 million nuclei across 172 maize inbreds. Our analyses pinpointed cis -regulatory elements distinct to domesticated maize and how transposons rewired the regulatory landscape. We found widespread chromatin accessibility variation associated with >4.6 million genetic variants with largely cell-type-specific effects. Variants in TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR binding sites were the most prevalent determinants of chromatin accessibility. Finally, integration of genetic variants associated with chromatin accessibility, organismal trait variation, and population differentiation revealed how local adaptation has rewired regulatory networks in unique cellular context to alter maize flowering phenotypes.

Summary Cis -regulatory elements (CREs) precisely control spatiotemporal gene expression in cells. Using a spatially resolved single-cell atlas of gene expression with chromatin accessibility across ten soybean tissues, we identified 103 distinct cell types and 303,199 accessible chromatin regions (ACRs). Nearly 40% of the ACRs showed cell-type-specific patterns and were enriched for transcription factor (TF) motifs defining diverse cell identities. We identified de novo enriched TF motifs and explored conservation of gene regulatory networks underpinning legume symbiotic nitrogen fixation. With comprehensive developmental trajectories for endosperm and embryo, we uncovered the functional transition of the three sub-cell types of endosperm, identified 13 sucrose transporters sharing the DOF11 motif that were co-up-regulated in late peripheral endosperm and identified key embryo cell-type specification regulators during embryogenesis, including a homeobox TF that promotes cotyledon parenchyma identity. This resource provides a valuable foundation for analyzing gene regulatory programs in soybean cell types across tissues and life stages.