During homeostasis, the endoplasmic reticulum (ER) maintains productive transmembrane and secretory protein folding that is vital for proper cellular function. The ER-resident HSP70 chaperone, BiP, plays a pivotal role in sensing ER stress to activate the unfolded protein response (UPR). BiP function is regulated by the bifunctional enzyme FicD that mediates AMPylation and deAMPylation of BiP in response to changes in ER stress. AMPylated BiP acts as a molecular rheostat to regulate UPR signaling, yet little is known about the molecular consequences of FicD loss. In this study, we investigate the role of FicD in mouse embryonic fibroblast (MEF) response to pharmacologically and metabolically induced ER stress. We find differential BiP AMPylation signatures when comparing robust chemical ER stress inducers to physiological glucose starvation stress and recovery. Wildtype MEFs respond to pharmacological ER stress by downregulating BiP AMPylation. Conversely, BiP AMPylation in wildtype MEFs increases upon metabolic stress induced by glucose starvation. Deletion of FicD results in widespread gene expression changes under baseline growth conditions. In addition, FicD null MEFs exhibit dampened UPR signaling, altered cell stress recovery response, and unconstrained protein secretion. Taken together, our findings indicate that FicD is important for tampering UPR signaling, stress recovery, and the maintenance of secretory protein homeostasis.

Abstract The unfolded protein response (UPR) is a cellular stress response that is activated when misfolded proteins accumulate in the endoplasmic reticulum (ER). The UPR elicits a signaling cascade that results in an upregulation of protein folding machinery and cell survival signals. However, prolonged UPR responses can result in elevated cellular inflammation, damage, and even cell death. Thus, regulation of the UPR response must be tuned to the needs of the cell, sensitive enough to respond to the stress but pliable enough to be stopped after the crisis has passed. Previously, we discovered that the bi-functional enzyme FicD can modulate the UPR response via post-translational modification of BiP. FicD AMPylates BiP during homeostasis and deAMPylates BiP during stress. We found this activity is important for the physiological regulation of the exocrine pancreas. Here, we explore the role of FicD in the murine liver. Like our previous studies, livers lacking FicD exhibit enhanced UPR signaling in response to short term physiologic fasting and feeding stress. However, the livers of FicD −/− did not show marked changes in UPR signaling or damage after either chronic high fat diet (HFD) feeding or acute pathological UPR induction. Intriguingly, FicD −/− mice showed changes in UPR induction and weight loss patterns following repeated pathological UPR induction. These findings show that FicD regulates UPR responses during mild physiological stress and may play a role in maintaining resiliency of tissue through adaptation to repeated ER stress.

Abstract Cancer evolves through a multistep process that occurs by the temporal accumulation of genetic mutations mediated by intracellular and extracellular cues. We observe that exosomes isolated from pancreatic cancer cells, but not normal pancreatic cells, can initiate the first step of malignant cell transformation. Injection of exosome-initiated transformed cells into mice results in aggressive tumor growth. Using proteomic profiling and DNA sequencing of exosome-treated and transformed cells, we show that cancer cell exosomes act as a classic initiator by causing random genetic changes in recipient cells. Our studies provide new insight into a function of cancer cell exosomes and how they might specifically contribute to orchestrated local cell transformation. One Sentence Summary Exosomes function as an initiator of tumor formation.

Abstract The proper balance of synthesis, folding, modification and degradation of proteins, also known as protein homeostasis, is vital to cellular health and function. The unfolded protein response (UPR) is activated when the mechanisms maintaining protein homeostasis in the endoplasmic reticulum (ER) become overwhelmed. However, prolonged or strong UPR responses can result in elevated inflammation and cellular damage. Previously, we discovered that the bifunctional enzyme Fic can modulate the UPR response via post-translational modification of BiP by AMPylation and deAMPylation. Loss of fic in Drosophila leads to vision defects and altered UPR activation in the fly eye. To investigate the importance of Fic-mediated AMPylation in a mammalian system, we generated a conditional null allele of Fic in mice and characterized the effect of Fic loss on the exocrine pancreas. Compared to controls, Fic -/- mice exhibit elevated serum markers for pancreatic dysfunction and display enhanced UPR signaling in the exocrine pancreas in response to physiologic and pharmacological stress. In addition, both fic -/- flies and Fic -/- mice show reduced capacity to recover from damage by stress that triggers the UPR. These findings show that Fic- mediated AMPylation acts as a molecular rheostat that is required to temper the UPR response in the mammalian pancreas during physiological stress.

ABSTRACT Rice blast disease caused by Magnaporthe oryzae is a devastating disease of cultivated rice worldwide. Infections by this fungus lead to a significant reduction in rice yields and threats to food security. To gain better insight into growth and cell death in M. oryzae during infection, we characterized two predicted M. oryzae metacaspase proteins, MoMca1 and MoMca2. These proteins appear to be functionally redundant and are able to complement the yeast Yca1 homologue. Biochemical analysis revealed that M. oryzae metacaspases exhibited Ca 2+ dependent caspase activity in vitro . Deletion of both MoMca1 and MoMca2 in M. oryzae resulted in reduced sporulation, delay in conidial germination and attenuation of disease severity. In addition, the double Δ Momca1mca2 mutant strain showed increased radial growth in the presence of oxidative stress. Interestingly, the Δ Momca1mca2 strain showed an increase accumulation of insoluble aggregates compared to the wild-type strain during vegetative growth. Our findings suggest that MoMca1 and MoMca2 promote the clearance of insoluble aggregates in M. oryzae , demonstrating the important role these metacaspases have in fungal protein homeostasis. Furthermore, these metacaspase proteins may play additional roles, like in regulating stress responses, that would help maintain the fitness of fungal cells required for host infection. IMPORTANCE Magnaporthe oryzae causes rice blast disease that threatens global food security by resulting in the severe loss of rice production every year. A tightly regulated life cycle allows M. oryzae to disarm the host plant immune system during its biotrophic stage before triggering plant cell death in its necrotrophic stage. The ways M. oryzae navigates its complex life cycle remains unclear. This work characterizes two metacaspase proteins with peptidase activity in M. oryzae that are shown to be involved in the regulation of fungal growth and development prior to infection by potentially helping maintain fungal fitness. This study provides new insight into the role of metacaspase proteins in filamentous fungi by illustrating the delays in M. oryzae morphogenesis in the absence of these proteins. Understanding the mechanisms by which M. oryzae morphology and development promote its devastating pathogenicity may lead to the emergence of proper methods for disease control.