During homeostasis, the endoplasmic reticulum (ER) maintains productive transmembrane and secretory protein folding that is vital for proper cellular function. The ER-resident HSP70 chaperone, BiP, plays a pivotal role in sensing ER stress to activate the unfolded protein response (UPR). BiP function is regulated by the bifunctional enzyme FicD that mediates AMPylation and deAMPylation of BiP in response to changes in ER stress. AMPylated BiP acts as a molecular rheostat to regulate UPR signaling, yet little is known about the molecular consequences of FicD loss. In this study, we investigate the role of FicD in mouse embryonic fibroblast (MEF) response to pharmacologically and metabolically induced ER stress. We find differential BiP AMPylation signatures when comparing robust chemical ER stress inducers to physiological glucose starvation stress and recovery. Wildtype MEFs respond to pharmacological ER stress by downregulating BiP AMPylation. Conversely, BiP AMPylation in wildtype MEFs increases upon metabolic stress induced by glucose starvation. Deletion of FicD results in widespread gene expression changes under baseline growth conditions. In addition, FicD null MEFs exhibit dampened UPR signaling, altered cell stress recovery response, and unconstrained protein secretion. Taken together, our findings indicate that FicD is important for tampering UPR signaling, stress recovery, and the maintenance of secretory protein homeostasis.

Abstract The unfolded protein response (UPR) is a cellular stress response that is activated when misfolded proteins accumulate in the endoplasmic reticulum (ER). The UPR elicits a signaling cascade that results in an upregulation of protein folding machinery and cell survival signals. However, prolonged UPR responses can result in elevated cellular inflammation, damage, and even cell death. Thus, regulation of the UPR response must be tuned to the needs of the cell, sensitive enough to respond to the stress but pliable enough to be stopped after the crisis has passed. Previously, we discovered that the bi-functional enzyme FicD can modulate the UPR response via post-translational modification of BiP. FicD AMPylates BiP during homeostasis and deAMPylates BiP during stress. We found this activity is important for the physiological regulation of the exocrine pancreas. Here, we explore the role of FicD in the murine liver. Like our previous studies, livers lacking FicD exhibit enhanced UPR signaling in response to short term physiologic fasting and feeding stress. However, the livers of FicD −/− did not show marked changes in UPR signaling or damage after either chronic high fat diet (HFD) feeding or acute pathological UPR induction. Intriguingly, FicD −/− mice showed changes in UPR induction and weight loss patterns following repeated pathological UPR induction. These findings show that FicD regulates UPR responses during mild physiological stress and may play a role in maintaining resiliency of tissue through adaptation to repeated ER stress.

Abstract Diverse bacterial pathogens employ effector delivery systems to disrupt vital cellular processes in the host ( 1 ). The type III secretion system 1 of the marine pathogen, Vibrio parahaemolyticus , utilizes the sequential action of four effectors to induce a rapid, pro-inflammatory cell death uniquely characterized by a pro-survival host transcriptional response ( 2, 3 ). Herein, we show that this pro-survival response is caused by the action of the channel-forming effector VopQ that targets the host V-ATPase resulting in lysosomal deacidification and inhibition of lysosome-autophagosome fusion. Recent structural studies have shown how VopQ interacts with the V-ATPase and, while in the ER, a V-ATPase assembly intermediate can interact with VopQ causing a disruption in membrane integrity. Additionally, we observe that VopQ-mediated disruption of the V-ATPase activates the IRE1 branch of the unfolded protein response (UPR) resulting in an IRE1-dependent activation of ERK1/2 MAPK signaling. We also find that this early VopQ-dependent induction of ERK1/2 phosphorylation is terminated by the VopS-mediated inhibitory AMPylation of Rho GTPase signaling. Since VopS dampens VopQ-induced IRE1-dependent ERK1/2 activation, we propose that IRE1 activates ERK1/2 phosphorylation at or above the level of Rho GTPases. This study illustrates how temporally induced effectors can work as in tandem as agonist/antagonist to manipulate host signaling and reveal new connections between V-ATPase function, UPR and MAPK signaling. Importance Vibrio parahaemolyticus (V. para) is a seafood-borne pathogen that encodes two Type 3 Secretion Systems (T3SS). The first system T3SS1 is thought to be maintained in all strains of V. para to to maintain survival in the environment, whereas the second sytem T3SS2 is linked to clinical isolates and disease in humans. Herein, we find that first system targets evolutionarily conserved signaling systems to manipulate host cells, eventually causing a rapid, orchestrated cells death within three hours. We have found that the T3SS1 injects virulence factors that temporally manipulate host signaling. Within the first hour of infection, the effector VopQ acts first by activating host surval signals while diminishing the host cell apoptotic machinery. Less than an hour later, another effector VopS reverses activation and inhibition of these signaling systems ultimately leading to death of the host cell. This work provides example of how pathogens have evolved to manipulate the interplay between T3SS effectors to regulate host signaling pathways.

Abstract Vacuolar-type ATPase (V-ATPase) is a rotary protein pump involved in proton translocation across various cellular membranes using the energy of ATP hydrolysis. Despite previous studies on bacterial and eukaryotic V-ATPases, information on the intact structure of a eukaryotic V-ATPase is missing. Here we report cryo-EM structures of the intact yeast V-ATPase and this complex bound to a bacterial effector. We reveal the interaction of the elusive regulatory subunit H with its neighboring subunits. Insight for the catalysis mechanism is gained by determining conformations of the catalytic subunits either empty or bound with nucleotides.

The propagation of species depends on the ability of germ cells to protect their genome in the face of numerous exogenous and endogenous threats. While these cells employ a number of known repair pathways, specialized mechanisms that ensure high-fidelity replication, chromosome segregation, and repair of germ cell genomes remain incompletely understood. Here, we identify Germ Cell Nuclear Acidic Peptidase (GCNA) as a highly conserved regulator of genome stability in flies, worms, zebrafish, and humans. GCNA contains a long acidic intrinsically disordered region (IDR) and a protease-like SprT domain. In addition to chromosomal instability and replication stress, GCNA mutants accumulate DNA-protein crosslinks (DPCs). GCNA acts in parallel with a second SprT domain protein Spartan. Structural analysis reveals that while the SprT domain is needed to limit meiotic and replicative damage, most of GCNA's function maps to its IDR. This work shows GCNA protects germ cells from various sources of damage, providing novel insights into conserved mechanisms that promote genome integrity across generations.

In response to environmental, developmental, and pathological stressors, cells engage homeostatic pathways to maintain their function. Among these pathways, the Unfolded Protein Response protects cells from the accumulation of misfolded proteins in the ER. Depending on ER stress levels, the ER-resident Fic protein catalyzes AMPylation or de-AMPylation of BiP, the major ER chaperone and regulator of the Unfolded Protein Response. This work elucidates the importance of the reversible AMPylation of BiP inmaintaining the Drosophila visual system in response to stress.After 72 hours of constant light, photoreceptors of fic-null and AMPylation-resistant BiPT366Amutants, but not wild-type flies, display loss of synaptic function, disintegration of rhabdomeres, and excessive activation of ER stress reporters. Strikingly, this phenotype is reversible: photoreceptors regain their structure and function within 72 hours once returned to a standard light:dark cycle. These findings show that Fic-mediated AMPylation of BiP is required for neurons to adapt to transient stress demands.

Abstract The proper balance of synthesis, folding, modification and degradation of proteins, also known as protein homeostasis, is vital to cellular health and function. The unfolded protein response (UPR) is activated when the mechanisms maintaining protein homeostasis in the endoplasmic reticulum (ER) become overwhelmed. However, prolonged or strong UPR responses can result in elevated inflammation and cellular damage. Previously, we discovered that the bifunctional enzyme Fic can modulate the UPR response via post-translational modification of BiP by AMPylation and deAMPylation. Loss of fic in Drosophila leads to vision defects and altered UPR activation in the fly eye. To investigate the importance of Fic-mediated AMPylation in a mammalian system, we generated a conditional null allele of Fic in mice and characterized the effect of Fic loss on the exocrine pancreas. Compared to controls, Fic -/- mice exhibit elevated serum markers for pancreatic dysfunction and display enhanced UPR signaling in the exocrine pancreas in response to physiologic and pharmacological stress. In addition, both fic -/- flies and Fic -/- mice show reduced capacity to recover from damage by stress that triggers the UPR. These findings show that Fic- mediated AMPylation acts as a molecular rheostat that is required to temper the UPR response in the mammalian pancreas during physiological stress.