Proteomics is the large scale study of protein structure and function from biological systems through protein identification and quantification. "Shotgun proteomics" or "bottom-up proteomics" is the prevailing strategy, in which proteins are hydrolyzed into peptides that are analyzed by mass spectrometry. Proteomics studies can be applied to diverse studies ranging from simple protein identification to studies of proteoforms, protein-protein interactions, protein structural alterations, absolute and relative protein quantification, post-translational modifications, and protein stability. To enable this range of different experiments, there are diverse strategies for proteome analysis. The nuances of how proteomic workflows differ may be challenging to understand for new practitioners. Here, we provide a comprehensive overview of different proteomics methods. We cover from biochemistry basics and protein extraction to biological interpretation and orthogonal validation. We expect this Review will serve as a handbook for researchers who are new to the field of bottom-up proteomics.

ABSTRACT Non-invasive detection of protein biomarkers in plasma is crucial for clinical purposes. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) is the gold standard technique for plasma proteome analysis, but despite recent advances, it remains limited by throughput, cost, and coverage. Here, we introduce a new hybrid method, which integrates direct infusion shotgun proteome analysis (DISPA) with nanoparticle (NP) protein coronas enrichment for high throughput and efficient plasma proteomic profiling. We realized over 280 protein identifications in 1.4 minutes collection time, which enables a potential throughput of approximately 1,000 samples daily. The identified proteins are involved in valuable pathways and 44 of the proteins are FDA approved biomarkers. The robustness and quantitative accuracy of this method were evaluated across multiple NPs and concentrations with a mean coefficient of variation at 17%. Moreover, different protein corona profiles were observed among various nanoparticles based on their distinct surface modifications, and all NP protein profiles exhibited deeper coverage and better quantification than neat plasma. Our streamlined workflow merges coverage and throughput with precise quantification, leveraging both DISPA and NP protein corona enrichments. This underscores the significant potential of DISPA when paired with NP sample preparation techniques for plasma proteome studies.

Skeletal muscle is a major regulatory tissue of whole-body metabolism and is composed of a diverse mixture of cell (fiber) types. Aging and several diseases differentially affect the various fiber types, and therefore, investigating the changes in the proteome in a fiber-type specific manner is essential. Recent breakthroughs in isolated single muscle fiber proteomics have started to reveal heterogeneity among fibers. However, existing procedures are slow and laborious requiring two hours of mass spectrometry time per single muscle fiber; 50 fibers would take approximately four days to analyze. Thus, to capture the high variability in fibers both within and between individuals requires advancements in high throughput single muscle fiber proteomics. Here we use a single cell proteomics method to enable quantification of single muscle fiber proteomes in 15 minutes total instrument time. As proof of concept, we present data from 53 isolated skeletal muscle fibers obtained from two healthy individuals analyzed in 13.25 hours. Adapting single cell data analysis techniques to integrate the data, we can reliably separate type 1 and 2A fibers. Sixty-five proteins were statistically different between clusters indicating alteration of proteins involved in fatty acid oxidation, muscle structure and regulation. Our results indicate that this method is significantly faster than prior single fiber methods in both data collection and sample preparation while maintaining sufficient proteome depth. We anticipate this assay will enable future studies of single muscle fibers across hundreds of individuals, which has not been possible previously due to limitations in throughput.

Proteomics is the large scale study of protein structure and function from biological systems through protein identification and quantification. "Shotgun proteomics" or "bottom-up proteomics" is the prevailing strategy, in which proteins are hydrolyzed into peptides that are analyzed by mass spectrometry. Proteomics studies can be applied to diverse studies ranging from simple protein identification to studies of proteoforms, protein-protein interactions, protein structural alterations, absolute and relative protein quantification, post-translational modifications, and protein stability. To enable this range of different experiments, there are diverse strategies for proteome analysis. The nuances of how proteomic workflows differ may be challenging to understand for new practitioners. Here, we provide a comprehensive overview of different proteomics methods to aid the novice and experienced researcher. We cover from biochemistry basics and protein extraction to biological interpretation and orthogonal validation. We expect this work to serve as a basic resource for new practitioners in the field of shotgun or bottom-up proteomics.

Abstract Single-cell transcriptomics (SCT) has revolutionized our understanding of cellular heterogeneity, yet the emergence of single-cell proteomics (SCP) promises a more functional view of cellular dynamics. A challenge is that not all mass spectrometry facilities can perform SCP, and not all labs have access to cell sorting equipment required for SCP, which together motivate an interest in sending bulk cell samples through the mail for sorting and SCP analysis. Shipping requires cell storage, which has an unknown impact on SCP results. This study investigates the impact of cell storage conditions on the proteomic landscape at the single-cell level utilizing a Data-Independent Acquisition (DIA) coupled with Parallel Accumulation Serial Fragmentation (diaPASEF). Three storage conditions were compared in 293T cells: (1) 37°C (control), (2) 4°C overnight, and (3) - 80°C storage followed by liquid nitrogen preservation. Either cold or frozen storage induced significant alterations in cell diameter, elongation, and proteome composition. By elucidating how cell storage conditions alter cellular morphology and proteome profiles, this study contributes foundational technical information about SCP sample preparation and data quality.

Abstract Combined multi-omics analysis of proteomics, polar metabolomics, and lipidomics requires separate liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) platforms for each omics layer. This requirement for different platforms limits throughput and increases costs, preventing the application of mass spectrometry-based multi-omics to large scale drug discovery or clinical cohorts. Here, we present an innovative strategy for simultaneous multi-omics analysis by direct infusion (SMAD) using one single injection without liquid chromatography. SMAD allows quantification of over 9,000 metabolite m/z features and over 1,300 proteins from the same sample in less than five minutes. We validated the efficiency and reliability of this method and then present two practical applications: mouse macrophage M1/M2 polarization and high throughput drug screening in human 293T cells. Finally, we demonstrate relationships between proteomic and metabolomic data are discovered by machine learning.

4013 Background: Accurate prediction of response and survival outcomes with anti-PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibition (ICI) remains a significant challenge in gastro-esophageal cancers. In this study, we use an artificial intelligence (AI)-based single-cell analysis of digitized whole-slide H&E images (WSIs) to predict objective response and survival benefit of ICI in two independent cohorts of gastro-esophageal cancer patients. Methods: WSIs were obtained from 82 ICI-treated advanced gastroesophageal cancer patients (gastric, esophageal, and gastro-esophageal junction adenocarcinoma and squamous cell carcinoma) at Stanford University for discovery, and 189 ICI-treated advanced gastric adenocarcinoma patients at Southern Medical University for external validation. Deep learning models were deployed for automated tumor area detection and segmentation of cell nuclei within WSIs. We developed a fully automated cell annotation approach by leveraging multiplex immunofluorescence and trained a deep learning model to classify nuclei into four cell types from H&E (tumor cells, lymphocytes, neutrophils, and macrophages). A total of 66 features were computed to quantify cell composition and cell-cell interactions within the tumor microenvironment. Treatment outcomes were assessed using progression-free survival (PFS) and best objective response per the Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (v1.1), with statistical significance reported at the 95% confidence level. Results: In the training cohort, a spatial feature characterizing lymphocyte and neutrophil interaction had the strongest association with PFS (hazard ratio = 0.44, 95% CI 0.24-0.79, P = 0.0046). In the validation cohort, the spatial biomarker positive population had significantly improved PFS compared to the spatial biomarker negative population (hazard ratio = 0.41, 95% CI 0.27-0.61, P < 0.0001; median time to event: 19 months vs 9 months). For predicting objective response in the validation cohort, a multivariate model combining the spatial features achieved AUROC = 0.81 compared to AUROC = 0.65 for PD-L1 CPS (P = 0.0014), while combining the multivariate model with PD-L1 CPS achieved AUROC = 0.84. Conclusions: A single-cell computational pathology approachidentifies spatial biomarkers with predictive utility for determining ICI treatment outcomes in advanced gastro-esophageal cancer. Further validation of these findings is being pursued in additional cohorts.