Abstract The mitochondrial Lon protease homolog (LonP1) hexamer controls mitochondrial health by digesting proteins from the mitochondrial matrix that are damaged or must be removed. Understanding how it is regulated requires characterizing its mechanism. Here, we show how human LonP1 functions, based on eight different conformational states that we determined by cryo-EM with a resolution locally extending to 3.6 Å for the best ordered states. LonP1 has a poorly ordered N-terminal part with apparent threefold symmetry, which apparently binds substrate protein and feeds it into its AAA+ unfoldase core. This translocates the extended substrate protein into a proteolytic cavity, in which we report an additional, previously unidentified Thr-type proteolytic center. Threefold rocking movements of the flexible N-terminal assembly likely assist thermal unfolding of the substrate protein. Our data suggest LonP1 may function as a sixfold cyclical Brownian ratchet controlled by ATP hydrolysis.

Abstract Cryo-transmission electron microscopy (cryo-EM) of frozen hydrated specimens is an efficient method for the structural analysis of purified biological molecules. However, for particles smaller than 50kDa, single particle cryo-EM often fails due to the limited imaging contrast of individual micrographs. For dose-resilient samples often studied in the physical sciences, electron ptychography – a coherent diffractive imaging technique using 4D scanning transmission electron microscopy (4D-STEM) – has recently demonstrated resolution down to tens of picometers for thin specimens imaged at room temperature. Here we applied ptychographic data analysis to frozen hydrated single protein particles, reaching sub-nanometer resolution 3D reconstructions. We employed low-dose cryo-EM with an aberration-corrected, convergent electron beam to collect 4D-STEM data for our reconstructions. The high speed of the electron detector allowed us to record large datasets of electron diffraction patterns with substantial overlaps between the interaction volumes of adjacent scan position, from which the scattering potentials of the samples were iteratively reconstructed. The reconstructed micrographs show strong contrast enabling the reconstruction of the structure of apoferritin protein at up to 5.8 Å resolution. Ptychography is a promising tool to study the structure of smaller frozen hydrated protein particles, and, once combined with electron tomography tilt series, bears the potential to provide unique insight into the ultrastructure of vitrified biological tissue.

Abstract The insertion of fusion proteins has enabled the crystallization of a wide range of G-protein-coupled receptors (GPCRs). Here, we explored the possibility of using a larger fusion protein, inserted into the third intracellular loop (ICL3) of β1-adrenoceptor (β1AR) via rigid chimeric helix fusions. The aim was to engineer a single-chain fusion protein that comprises sufficient mass and rigidity to allow single-particle cryo-EM data collection, without depending on binding proteins, such as G-proteins or nanobodies. Through parsing of the protein data bank (PDB), we identified the protein AmpC β-lactamase as a suitable candidate. Both termini of this protein are α-helical and the helices are antiparallel to each other. The distance between their centroids measures ∼11 Å. Such a geometry is ideal to design extended chimeric helices with transmembrane (TM) helices 5 and 6 of β1AR, and the insertion of the protein adds ∼39 kDa of mass to the receptor. We expressed the β1AR - AmpC β-lactamase fusion protein in mammalian cells. The binding of the antagonists propranolol and cyanopindolol to the purified fusion protein was confirmed by CPM-based thermofluor assays. The cryo-EM structure was solved to a nominal overall resolution of 3.6 Å and the seven helix architecture and helix eight were clearly resolved. Superimposition of the structure with known X-ray crystal structures of β1AR suggests that the protein is in its inactive conformation. The fusion protein described here provides a basis for high-throughput structure elucidation of class A GPCRs by cryo-EM for drug discovery research as well as for the elucidation of inactive state or wild-type GPCR structures. The fusion protein geometry theoretically fits a wide range of class A GPCRs and therefore can be applied to a multitude of receptors.

Abstract Adenylyl cyclase 9 (AC9) is a membrane-bound enzyme that converts ATP into cAMP. The enzyme is weakly activated by forskolin, fully activated by the G protein Gαs subunit and is autoinhibited by the AC9 C-terminus. Although our recent structural studies of the AC9-Gαs complex provided the framework for understanding AC9 autoinhibition, the conformational changes that AC9 undergoes in response to activator binding remains poorly understood. Here, we present the cryo-EM structures of AC9 in several distinct states: (i) AC9 bound to a nucleotide inhibitor MANT-GTP, (ii) bound to an artificial activator (DARPin C4) and MANT-GTP, (iii) bound to DARPin C4 and a nucleotide analogue ATPαS, (iv) bound to Gαs and MANT-GTP. The artificial activator DARPin C4 partially activates AC9 by binding at a site that overlaps with the Gαs binding site. Together with the previously observed occluded and forskolin-bound conformations, structural comparisons of AC9 in the four new conformations show that secondary structure rearrangements in the region surrounding the forskolin binding site are essential for AC9 activation. One Sentence Summary Cryo-EM reveals activator-induced conformational changes in adenylyl cyclase AC9

Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of integral membrane proteins and represent key targets for pharmacological research. GPCRs modulate cell physiology by engaging and activating a diversity of intracellular transducers, prominently heterotrimeric G proteins, but also G protein-receptor kinases (GRKs) and arrestins. The recent surge in the number of structures of GPCR-G protein complexes has expanded our understanding of G protein recognition and GPCR-mediated signal transduction. However, many aspects of these mechanisms, including the existence of transient interactions with transducers, have remained elusive. Here, we present the cryo-EM structure of the light-sensitive GPCR rhodopsin in complex with heterotrimeric Gi. In contrast to all reported structures, our density map reveals the receptor C-terminal tail bound to the Gβ subunit of the G protein heterotrimer. This observation provides a structural foundation for the role of the C-terminal tail in GPCR signaling, and of Gβ as scaffold for recruiting Gα subunits and GRKs. By comparing all available complex structures, we found a small set of common anchoring points that are G protein-subtype specific. Taken together, our structure and analysis provide new structural basis for the molecular events of the GPCR signaling pathway.

High-resolution structural information is essential to understand protein function. Protein-structure determination needs a considerable amount of protein, which can be challenging to produce, often involving harsh and lengthy procedures. In contrast, the several thousands to a few million protein particles required for structure-determination by cryogenic electron microscopy (cryo-EM) can be provided by miniaturized systems. Here, we present a microfluidic method for the rapid isolation of a target protein and its direct preparation for cryo-EM. Less than one microliter of cell lysate is required as starting material to solve the atomic structure of the untagged, endogenous human 20S proteasome. Our work paves the way for high-throughput structure determination of proteins from minimal amounts of cell lysate and opens new opportunities for the isolation of sensitive, endogenous protein complexes.

Abstract Multiple system atrophy (MSA) is a rapidly progressive neurodegenerative disease of unknown etiology, typically affecting individuals aged 50-60 and leading to patient death within a decade 1–3 . Characterized by the presence of oligodendroglial intracellular aggregates (GCIs) primarily composed of fibrillar alpha-synuclein (aSyn) 4–8 , formation of MSA neuropathology presents similarities to prion propagation 9,10 . While previous investigations have scrutinized fibrils extracted from MSA brains 11 , their “protein-only” replication was questioned 12 and their capacity to induce GCIs in animal models was not explored. Conversely, the synthetic fibril strain 1B 13,14 assembled from recombinant human aSyn self-replicates autonomously in vitro and induces GCIs in mice 15 , suggesting relevance to MSA. Here we report the high-resolution structural analysis of the 1B fibrils revealing similarities with human brain extracted MSA aSyn filaments, particularly the lack of a specific Thioflavin T (ThT) binding pocket 16 . In addition, 1B causes sustained intracerebral GCI spread over the years, prompt lethality in transgenic mice, and transmission of inclusion pathology to wild-type animals after crude brain homogenate inoculation. This points to an underlying prion-like seeding process which we demonstrate in situ using correlative light-electron microscopy. Our findings underscore structural features of aSyn fibrils pivotal for MSA pathogenesis and provide insights for therapeutic development.