Senescence is a stress-responsive tumor suppressor mechanism associated with expression of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Through the SASP, senescent cells trigger their own immune-mediated elimination, which if evaded leads to tumorigenesis. Senescent parenchymal cells are separated from circulating immunocytes by the endothelium, which is targeted by microenvironmental signaling. Here we show that SASP induces endothelial cell NF-κB activity and that SASP-induced endothelial expression of the canonical NF-κB component Rela underpins senescence surveillance. Using human liver sinusoidal endothelial cells (LSECs), we show that SASP-induced endothelial NF-κB activity regulates a conserved transcriptional program supporting immunocyte recruitment. Furthermore, oncogenic hepatocyte senescence drives murine LSEC NF-κB activity in vivo. Critically, we show two distinct endothelial pathways in senescence surveillance. First, endothelial-specific loss of Rela prevents development of Stat1-expressing CD4+ T lymphocytes. Second, the SASP up-regulates ICOSLG on LSECs, with the ICOS-ICOSLG axis contributing to senescence cell clearance. Our results show that the endothelium is a nonautonomous SASP target and an organizing center for immune-mediated senescence surveillance.

Abstract Summary SpatialExperiment is a new data infrastructure for storing and accessing spatially resolved transcriptomics data, implemented within the R/Bioconductor framework, which provides advantages of modularity, interoperability, standardized operations, and comprehensive documentation. Here, we demonstrate the structure and user interface with examples from the 10x Genomics Visium and seqFISH platforms, and provide access to example datasets and visualization tools in the STexampleData , TENxVisiumData , and ggspavis packages. Availability and Implementation The SpatialExperiment , STexampleData , TENxVisiumData , and ggspavis packages are available from Bioconductor. The package versions described in this manuscript are available in Bioconductor version 3.15 onwards. Contact risso.davide@gmail.com , shicks19@jhu.edu Supplementary Information Supplementary Tables and Figures are available online.

Abstract The role of Transposable Elements (TEs) in regulating diverse biological processes, from early development to cancer, is becoming increasing appreciated. However, unlike other biological processes, next generation single-cell sequencing technologies are ill-suited for assaying TE expression: in particular, their highly repetitive nature means that short cDNA reads cannot be unambiguously mapped to a specific locus. Consequently, it is extremely challenging to understand the mechanisms by which TE expression is regulated and how they might themselves regulate other protein coding genes. To resolve this, we introduce CELLO-seq, a novel method and computational framework for performing long-read RNA sequencing at single cell resolution. CELLO-seq allows for full-length RNA sequencing and enables measurement of allelic, isoform and TE expression at unique loci. We use CELLO-seq to assess the widespread expression of TEs in 2-cell mouse blastomeres as well as human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Across both species, old and young TEs showed evidence of locus-specific expression, with simulations demonstrating that only a small number of very young elements in the mouse could not be mapped back to with high confidence. Exploring the relationship between the expression of individual elements and putative regulators revealed surprising heterogeneity, with TEs within a class showing different patterns of correlation, suggesting distinct regulatory mechanisms.

Abstract We present kana, a web application for interactive single-cell ‘omics data analysis in the browser. Like, literally, in the browser: kana leverages web technologies such as WebAssembly to efficiently perform the relevant computations on the user’s machine, avoiding the need to provision and maintain a backend service. The application provides a streamlined one-click workflow for the main steps in a typical single-cell analysis, starting from a count matrix and finishing with marker detection. Results are presented in an intuitive web interface for further exploration and iterative analysis. Testing on public datasets shows that kana can analyze over 100,000 cells within 5 minutes on a typical laptop.

Transcription factors (TFs) and transcriptional coregulators represent an emerging and exciting class of targets. By quantifying target gene modulation, gene regulatory networks (GRNs) delineate disease biology and evaluate pharmacological agents targeting these regulators. However, none of the existing methods are explicitly designed to measure the effects of perturbations in which TF expression is decoupled from its activity. We present Epiregulon, a method that constructs GRNs from single-cell ATAC-seq and RNA-seq data for accurate prediction of TF activity. Our weight estimation, based on co-occurrence of TF expression and chromatin accessibility, avoids erroneous inflation of TF activity as seen with TF expression only approaches. Furthermore, our utilization of ChIP-seq data expands inference to transcriptional coregulators lacking defined motifs. Our extensive network of regulators facilitates identification of cell-state specific interaction partners. Using Epiregulon, we uncover divergent cell fate transitions of prostate cancer cells driven by NKX2-1 and GATA6 overexpression. We accurately predicted the effects of AR inhibition across various drug modalities. Finally, Epiregulon was able to infer the context-dependent activity of a chromatin remodeler lacking a defined motif sequence and recapitulate the unique etiologies of prostate cancer. By mapping out the network of key regulators across a multitude of perturbations, Epiregulon can accelerate the discovery of new therapeutics targeting transcription factors.

Abstract The success of CRISPR-mediated gene perturbation studies is highly dependent on the quality of gRNAs, and several tools have been developed to enable optimal gRNA design. However, these tools are not all adaptable to the latest CRISPR modalities or nucleases, nor do they offer comprehensive annotation methods for advanced CRISPR applications. Here, we present a new ecosystem of R packages, called crispr-Verse , that enables efficient gRNA design and annotation for a multitude of CRISPR technologies. This includes CRISPR knockout (CRISPRko), CRISPR activation (CRISPRa), CRISPR interference (CRISPRi), CRISPR base editing (CRISPRbe) and CRISPR knockdown (CRISPRkd). The core package, crisprDesign , offers a comprehensive, user-friendly, and unified interface to add on- and off-target annotations via several alignment methods, rich gene and SNP annotations, and a dozen on- and off-target activity scores. These functionalities are enabled for any RNA- or DNA-targeting nucleases, including Cas9, Cas12, and Cas13. We illustrate the general applicability of our tools by designing optimal gRNAs for three case studies: tiling CRISPRbe library for BRCA1 using the base editor BE4max, tiling RNA-targeting libraries for CD46 and CD55 using CasRx, and activation of MMP7 using CRISPRa. The crisprVerse ecosystem is open-source and deployed through the Bioconductor project to facilitate its use by the CRISPR community ( https://github.com/crisprVerse ).

Ferroptosis is an iron-dependent cell death mechanism characterized by the accumulation of toxic lipid peroxides and cell membrane rupture. GPX4 (glutathione peroxidase 4) prevents ferroptosis by reducing these lipid peroxides into lipid alcohols. Ferroptosis induction by GPX4 inhibition has emerged as a vulnerability of cancer cells, highlighting the need to identify ferroptosis regulators that may be exploited therapeutically. Through genome-wide CRISPR activation screens, we identify the SWI/SNF (switch/sucrose non-fermentable) ATPases BRM (SMARCA2) and BRG1 (SMARCA4) as ferroptosis suppressors. Mechanistically, they bind to and increase chromatin accessibility at NRF2 target loci, thus boosting NRF2 transcriptional output to counter lipid peroxidation and confer resistance to GPX4 inhibition. We further demonstrate that the BRM/BRG1 ferroptosis connection can be leveraged to enhance the paralog dependency of BRG1 mutant cancer cells on BRM. Our data reveal ferroptosis induction as a potential avenue for broadening the efficacy of BRM degraders/inhibitors and define a specific genetic context for exploiting GPX4 dependency.

An increasing number of studies are using single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) to characterize the gene expression profiles of individual cells. One common analysis applied to scRNA-seq data involves detecting differentially expressed (DE) genes between cells in different biological groups. However, many experiments are designed such that the cells to be compared are processed in separate plates or chips, meaning that the groupings are confounded with systematic plate effects. This confounding aspect is frequently ignored in DE analyses of scRNA-seq data. In this article, we demonstrate that failing to consider plate effects in the statistical model results in loss of type I error control. A solution is proposed whereby counts are summed from all cells in each plate and the count sums for all plates are used in the DE analysis. This restores type I error control in the presence of plate effects without compromising detection power in simulated data. Summation is also robust to varying numbers and library sizes of cells on each plate. Similar results are observed in DE analyses of real data where the use of count sums instead of single-cell counts improves specificity and the ranking of relevant genes. This suggests that summation can assist in maintaining statistical rigour in DE analyses of scRNA-seq data with plate effects.

edgeR is an R/Bioconductor software package for differential analyses of sequencing data in the form of read counts for genes or genomic features. Over the past 15 years, edgeR has been a popular choice for statistical analysis of data from sequencing technologies such as RNA-seq or ChIP-seq. edgeR pioneered the use of the negative binomial distribution to model read count data with replicates and the use of generalized linear models to analyse complex experimental designs. edgeR implements empirical Bayes moderation methods to allow reliable inference when the number of replicates is small. This article announces edgeR version 4, which includes new developments across a range of application areas. Infrastructure improvements include support for fractional counts, implementation of model fitting in C++, and a new statistical treatment of the quasi-likelihood pipeline that improves accuracy for small counts. The revised package has new functionality for differential methylation analysis, differential transcript expression, differential transcript and exon usage, testing relative to a fold-change threshold and pathway analysis. This article reviews the statistical framework and computational implementation of edgeR, briefly summarizing all the existing features and functionalities but with special attention to new features and those that have not been described previously.

Genome stability relies on proper coordination of mitosis and cytokinesis, where dynamic microtubules capture and faithfully segregate chromosomes into daughter cells. The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in controlling these processes however remains largely unexplored. To identify lncRNAs with mitotic functions, we performed a high-content RNAi imaging screen targeting more than 2,000 human lncRNAs. By investigating major hallmarks of cell division such as chromosome segregation, mitotic duration and cytokinesis, we discovered numerous lncRNAs with functions in each of these processes. The chromatin-associated lncRNA, linc00899, was selected for in-depth studies due to the robust mitotic delay observed upon its depletion. Transcriptome analysis of linc00899-depleted cells together with gain-of-function and rescue experiments across multiple cell types identified the neuronal microtubule-binding protein, TPPP/p25, as a target of linc00899. Linc00899 binds the genomic locus of TPPP/p25 and suppresses its transcription through a cis-acting mechanism. In cells depleted of linc00899, the consequent upregulation of TPPP/p25 alters microtubule dynamics and is necessary and sufficient to delay mitosis. Overall, our comprehensive screen identified several lncRNAs with roles in genome stability and revealed a new lncRNA that controls microtubule behaviour with functional implications beyond cell division.