Abstract All smooth muscle cell (SMC) restricted Cre mice recombine floxed alleles in vascular and visceral SMCs. We generated a new tamoxifen-inducible CreER T2 mouse, Itga8-CreER T2 , and compared its activity to the widely used Myh11-CreER T2 mouse. Both CreER T2 mice showed similar activity in vascular SMCs; however, Itga8-CreER T2 displayed limited activity in visceral SMC-containing tissues ( e.g. , intestine). Myh11-CreER T2 (but not Itga8-CreER T2 ) mice displayed high levels of CreER T2 protein, tamoxifen-independent activity, and an altered transcriptome. Whereas Myh11-CreER T2 -mediated knockout of Srf resulted in a lethal intestinal phenotype, loss of Srf with Itga8-CreER T2 ( Srf Itga8 ) revealed viable mice with attenuated vascular SMC contractile gene expression, but no evidence of intestinal pathology. Male and female Srf Itga8 mice presented with vascular contractile incompetence; however, only male Srf Itga8 mice showed systemic changes in blood pressure. These results establish the Itga8-CreER T2 mouse as an alternative to existing SMC Cre strains, including Myh11-CreER T2 , where SMC gene loss results in visceral myopathies that obfuscate accurate phenotyping in vascular SMCs.

ABSTRACT Lymphoedema, a common dysfunction of the lymphatic system, results in fluid accumulating between cells. Fluid return through the lymphatic vascular system is primarily provided by contractions of muscle cells in the walls of lymphatic vessels, driven by electrochemical oscillations causing rhythmic action potentials and associated surges in intracellular calcium ion concentration. There is incomplete understanding of the mechanisms involved in these repeated events, restricting the development of pharmacological treatments for dysfunction. Previously, we proposed a model where autonomous oscillations in the membrane potential (M-clock) drove passive oscillations in the calcium concentration (C-clock). In this paper, to model more accurately what is known about the underlying physiology, we extend this model to the case where the M-clock and the C-clock oscillators are both active but coupled together, and thus both driving the action potentials. This extension results from modifications to the model for the IP 3 receptor, a key C-clock mechanism. The synchronized dual-driving clock behaviour enables the model to match IP 3 receptor knock-out data, resolving an issue with previous models. We also use phase-plane analysis to explain the mechanisms for the dual-clock coupling. The model has the potential to help determine mechanisms and find targets for pharmacological treatment of lymphoedema.

We assembled and analyzed genetic data of 47,351 multiple sclerosis (MS) subjects and 68,284 control subjects and establish a reference map of the genetic architecture of MS that includes 200 autosomal susceptibility variants outside the major histocompatibility complex (MHC), one chromosome X variant, and 32 independent associations within the extended MHC. We used an ensemble of methods to prioritize up to 551 potentially associated MS susceptibility genes, that implicate multiple innate and adaptive pathways distributed across the cellular components of the immune system. Using expression profiles from purified human microglia, we do find enrichment for MS genes in these brain-resident immune cells. Thus, while MS is most likely initially triggered by perturbation of peripheral immune responses the functional responses of microglia and other brain cells are also altered and may have a role in targeting an autoimmune process to the central nervous system.

Abstract Background Rheumatoid arthritis (RA) is a progressive immune-mediated inflammatory disease characterized by intermittent episodes of pain and inflammation in affected joints, or flares. Recent studies demonstrated lymphangiogenesis and expansion of draining lymph nodes during chronic inflammatory arthritis, and lymphatic dysfunction associated with collapse of draining lymph nodes in RA patients and TNF-transgenic (TNF-Tg) mice experiencing arthritic flare. As the intrinsic differences between lymphatic vessels afferent to healthy, expanding, and collapsed draining lymph nodes are unknown, we characterized the ex vivo behavior of popliteal lymphatic vessels (PLVs) from WT and TNF-Tg mice. We also interrogated the mechanisms of lymphatic dysfunction through inhibition of nitric oxide synthase (NOS). Methods Popliteal lymph nodes (PLNs) in TNF-Tg mice were phenotyped as Expanding or Collapsed by in vivo ultrasound and age-matched to WT littermate controls. The PLVs were harvested and cannulated for ex vivo functional analysis over a relatively wide range of hydrostatic pressures (0.5 to 10 cmH 2 O) to quantify the end diastolic diameter (EDD), tone, amplitude (AMP), ejection fraction (EF), contraction frequency (FREQ) and fractional pump flow (FPF) with or without NOS inhibitors Data was analyzed using repeated measures two-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test. Results Real time videos of the cannulated PLVs demonstrated the predicted phenotypes of robust versus weak contractions of the WT versus TNF-Tg PLV, respectively. Quantitative analyses confirmed that TNF-Tg PLVs had significantly decreased AMP, EF and FPF versus WT (p<0.05). EF and FPF were recovered by NOS inhibition, while the reduction in AMP was NOS independent. No differences in EDD, tone, or FREQ were observed between WT and TNF-Tg PLVs, nor between Expanding versus Collapsed PLVs. Conclusion These findings support the concept that chronic inflammatory arthritis leads to NOS dependent and independent draining lymphatic vessel dysfunction that exacerbates disease, and may trigger arthritic flare due to decreased egress of inflammatory cells and soluble factors from affected joints.

ABSTRACT Lymphoedema develops due to chronic dysfunction of the lymphatic vascular system which results in fluid accumulation between cells. The condition is commonly acquired secondary to diseases such as cancer or the therapies associated with it. The primary driving force for fluid return through the lymphatic vasculature is provided by contractions of the muscularized lymphatic collecting vessels, driven by electrical oscillations. However, there is an incomplete understanding of the molecular and bioelectric mechanisms involved in lymphatic muscle cell excitation, hampering the development and use of pharmacological therapies. Modelling in silico has contributed greatly to understanding the contributions of specific ion channels to the cardiac action potential, but modelling of these processes in lymphatic muscle remains limited. Here, we propose a model of oscillations in the membrane voltage (M-clock) and intracellular calcium concentrations (C-clock) of lymphatic muscle cells. We modify a model by Imtiaz and colleagues to enable the M-clock to drive the C-clock oscillations. This approach differs from typical models of calcium oscillators in lymphatic and related cell types, but is required to fit recent experimental data. We include an additional voltage dependence in the gating variable control for the L-type calcium channel, enabling the M-clock to oscillate independently of the C-clock. We use phase-plane analysis to show that these M-clock oscillations are qualitatively similar to those of a generalised FitzHugh-Nagumo model. We also provide phase plane analysis to understand the interaction of the M-clock and C-clock oscillations. The model and methods have the potential to help determine mechanisms and find targets for pharmacological treatment of lymphoedema.

RASA1, a negative regulator of the Ras-mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, is essential for the development and maintenance of lymphatic vessel (LV) valves. However, whether RASA1 is required for the development and maintenance of lymphovenous valves (LVV) and venous valves (VV) is unknown. In this study we show that induced endothelial cell (EC)-specific disruption of Rasa1 in mid-gestation mouse embryos did not affect initial specification of LVV or central VV but did affect their continued development. Similarly, switch to expression of a catalytically inactive form of RASA1 resulted in impaired LVV and VV development. Blocked development of LVV in RASA1-deficient embryos was associated with accumulation of the basement membrane protein, collagen IV, in LVV-forming EC and could be partially or completely rescued by MAPK inhibitors and drugs that promote collagen IV folding. Disruption of Rasa1 in adult mice resulted in venous hypertension and impaired VV function that was associated with loss of EC from VV leaflets. In conclusion, RASA1 functions as a negative regulator of Ras signaling in EC that is necessary for EC export of collagen IV, thus permitting the development of LVV and the development and maintenance of VV.

Collecting lymphatic vessels (cLVs) exhibit spontaneous contractions with a pressure-dependent frequency, but the identity of the lymphatic pacemaker cell is still debated. By analogy to pacemakers in the GI and lower urinary tracts, proposed cLV pacemaker cells include interstitial cells of Cajal like cells (ICLC), pericytes, as well as the lymphatic muscle (LMCs) cells themselves. Here we tested the extent to which these cell types are invested into the mouse cLV wall and if any cell type exhibited morphological and functional processes characteristic of pacemaker cells: a contiguous network; spontaneous Ca 2+ transients; and depolarization-induced propagated contractions. We employed inducible Cre (iCre) mouse models routinely used to target these specific cell populations including: c-kitCreER T2 to target ICLC; PdgfrβCreER T2 to target pericytes; PdgfrαCreER TM to target CD34 + adventitial fibroblast-like cells or ICLC; and Myh11CreER T2 to target LMCs. These specific inducible Cre lines were crossed to the fluorescent reporter ROSA26mT/mG, the genetically encoded Ca 2+ sensor GCaMP6f, and the light-activated cation channel rhodopsin2 (ChR2). c-KitCreER T2 labeled both a sparse population of LECs and round adventitial cells that responded to the mast cell activator compound 48-80. PdgfrβCreER T2 drove recombination in both adventitial cells and LMCs, limiting its power to discriminate a pericyte specific population. PdgfrαCreER TM labeled a large population of interconnected, oak leaf-shaped cells primarily along the adventitial surface of the vessel. Titrated induction of the smooth muscle-specific Myh11CreER T2 revealed a LMC population with heterogeneous morphology. Only LMCs consistently, but heterogeneously, displayed spontaneous Ca 2+ events during the diastolic period of the contraction cycle, and whose frequency was modulated in a pressure-dependent manner. Optogenetic depolarization through the expression of ChR2 by Myh11CreER T2 , but not PdgfrαCreER TM or c-KitCreER T2 , resulted in a propagated contraction. These findings support the conclusion that LMCs, or a subset of LMCs, are responsible for mouse cLV pacemaking.The presence and functionality of proposed pacemaker cells in collecting lymphatic vessels was tested with various mouse Cre models to drive expression of a recombination reporter ROSA26mT/mG, a genetically encoded Ca 2+ sensor GCaMP6f, or the optogenetic tool channel-rhodopsin2. Lymphatic CD34 + adventitial cells co-express PDGFRΑ + while cKit + cells are mast cells; and neither cell type demonstrated pacemaking functionality. Myh11CreER T2 identified lymphatic muscle cells which exhibited pacemaker behaviors such as pressure-dependent calcium events during diastole and propagated contraction induced by optical stimulation of channel-rhodopsin2.