Understanding the molecular programs that guide differentiation during development is a major challenge. Here, we introduce Waddington-OT, an approach for studying developmental time courses to infer ancestor-descendant fates and model the regulatory programs that underlie them. We apply the method to reconstruct the landscape of reprogramming from 315,000 single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) profiles, collected at half-day intervals across 18 days. The results reveal a wider range of developmental programs than previously characterized. Cells gradually adopt either a terminal stromal state or a mesenchymal-to-epithelial transition state. The latter gives rise to populations related to pluripotent, extra-embryonic, and neural cells, with each harboring multiple finer subpopulations. The analysis predicts transcription factors and paracrine signals that affect fates and experiments validate that the TF Obox6 and the cytokine GDF9 enhance reprogramming efficiency. Our approach sheds light on the process and outcome of reprogramming and provides a framework applicable to diverse temporal processes in biology.

Abstract Understanding the molecular programs that guide cellular differentiation during development is a major goal of modern biology. Here, we introduce an approach, WADDINGTON-OT, based on the mathematics of optimal transport, for inferring developmental landscapes, probabilistic cellular fates and dynamic trajectories from large-scale single-cell RNA-seq (scRNA-seq) data collected along a time course. We demonstrate the power of WADDINGTON-OT by applying the approach to study 65,781 scRNA-seq profiles collected at 10 time points over 16 days during reprogramming of fibroblasts to iPSCs. We construct a high-resolution map of reprogramming that rediscovers known features; uncovers new alternative cell fates including neuraland placental-like cells; predicts the origin and fate of any cell class; highlights senescent-like cells that may support reprogramming through paracrine signaling; and implicates regulatory models in particular trajectories. Of these findings, we highlight Obox6 , which we experimentally show enhances reprogramming efficiency. Our approach provides a general framework for investigating cellular differentiation.

ABSTRACT Understanding how cells remember previous mechanical environments to influence their fate, or mechanical memory, informs the design of biomaterials and therapies in medicine. Current regeneration therapies require two-dimensional (2D) cell expansion processes to achieve large cell populations critical for the repair of damaged (e.g. connective and musculoskeletal) tissues. However, the influence of mechanical memory on cell fate following expansion is unknown, and mechanisms defining how physical environments influence the therapeutic potential of cells remain poorly understood. Here, we show that the organization of histone H3 trimethylated at lysine 9 (H3K9me3) and expression of tissue-identifying genes in primary cartilage cells (chondrocytes) transferred to three-dimensional (3D) hydrogels depends on the number of previous population doublings on tissue culture plastic during 2D cell expansion. Decreased levels of H3K9me3 occupying promoters of dedifferentiation genes after the 2D culture were also retained in 3D culture. Suppression of H3K9me3 during expansion of cells isolated from a murine model similarly resulted in the loss of the chondrocyte phenotype and global remodeling of nuclear architecture. In contrast, increasing levels of H3K9me3 through inhibiting H3K9 demethylases partially rescued the chondrogenic nuclear architecture and gene expression, which has important implications for tissue repair therapies, where expansion of large numbers of phenotypically-suitable cells is required. Overall, our findings indicate mechanical memory in primary cells is encoded in the chromatin architecture, which impacts cell fate and the phenotype of expanded cells. SIGNIFICANCE STATEMENT Tissue regeneration procedures, such as cartilage defect repair (e.g. Matrix-induced Autologous Chondrocyte Implantation) often require cell expansion processes to achieve sufficient cells to transplant into an in vivo environment. However, the chondrocyte cell expansion on 2D stiff substrates induces epigenetic changes that persist even when the chondrocytes are transferred to a different (e.g. 3D) or in vivo environment. Treatments to alter epigenetic gene regulation may be a viable strategy to improve existing cartilage defect repair procedures and other tissue engineering procedures that involve cell expansion.