Glaucoma is characterized by retinal ganglion cell (RGC) pathology and a progressive loss of vision. Previous studies suggest RGC death is responsible for vision loss in glaucoma, yet evidence from other neurodegenerative diseases suggests axonal degeneration, in the absence of neuronal loss, can significantly affect neuronal function. To characterize RGC degeneration in the DBA/2 mouse model of glaucoma, we quantified RGCs in mice of various ages using neuronal-specific nuclear protein (NeuN) immunolabeling, retrograde labeling, and optic nerve axon counts. Surprisingly, the number of NeuN-labeled RGCs did not decline significantly until 18 months of age, at which time a significant decrease in RGC somal size was also observed. Axon dysfunction and degeneration occurred before loss of NeuN-positive RGCs, because significant declines in RGC number assayed by retrograde tracers and axon counts were observed at 13 months. To examine whether axonal dysfunction/degeneration affected gene expression in RGC axons or somas, NeuN and neurofilament-heavy (NF-H) immunolabeling was performed along with quantitative reverse transcription-PCR for RGC-specific genes in retinas of aged DBA/2 mice. Although these mice had similar numbers of NeuN-positive RGCs, the expression of neurofilament light, Brn-3b, and Sncg mRNA varied; this variation in RGC-specific gene expression was correlated with the appearance of NF-H immunoreactive RGC axons. Together, these data support a progression of RGC degeneration in this model of glaucoma, beginning with loss of retrograde label, where axon dysfunction and degeneration precede neuronal loss. This progression of degeneration suggests a need to examine the RGC axon as a locus of pathology in glaucoma.

Abstract Changes in microglial cell activation and distribution are associated with neuronal decline in the central nervous system (CNS), particularly under pathological conditions. Activated microglia converge on the initial site of axonal degeneration in human glaucoma, yet their part in its pathophysiology remains unresolved. To begin with, it is unknown whether microglia activation precedes or is a late consequence of retinal ganglion cell (RGC) neurodegeneration. Here we address this critical element in DBA/2J (D2) mice, an established model of chronic inherited glaucoma, using as a control the congenic substrain DBA/2J Gpnmb +/SjJ (D2G), which is not affected by glaucoma. We analyzed the spatial distribution and timecourse of microglial changes in the retina, as well as within the proximal optic nerve prior to and throughout ages when neurodegeneration has been reported. Exclusively in D2 mice, we detected early microglia clustering in the inner central retina and unmyelinated optic nerve regions, with microglia activation peaking by 3 months of age. Between 5 and 8 months of age, activated microglia persisted and concentrated in the optic disc, but also localized to the retinal periphery. Collectively, our findings suggest microglia activation is an early alteration in the retina and optic nerve in D2 glaucoma, potentially contributing to disease onset or progression. Ultimately, detection of microglial activation may have value in early disease diagnosis, while modulation of microglial responses may alter disease progression. J. Comp. Neurol. 519:599–620, 2011. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.

purpose. In the context of the retinal ganglion cell (RGC) axon degeneration in the optic nerve that occurs in glaucoma, microglia become activated, then phagocytic, and redistribute in the optic nerve head. The authors investigated the potential contribution of retinal microglia activation to glaucoma progression in the DBA/2J chronic mouse glaucoma model. methods. The authors treated 6-week-old DBA/2J mice for 25 weeks with minocycline, a tetracycline derivative known to reduce microglia activation and to improve neuronal survival in other models of neurodegenerative disease. They quantified RGC numbers and characterized microglia activation, gliosis, and both axonal integrity and retrograde tracer transport by RGCs in mice systemically treated with minocycline or vehicle only. results. Minocycline reduced microglial activation and improved RGC axonal transport and integrity, yet it had no effect on the characteristic age-related ocular changes that lead to chronically elevated pressure and did not alter Müller or astrocyte gliosis. Specifically, minocycline increased the fraction of microglia with resting ramified morphology and reduced levels of Iba1 mRNA and protein, a microglia-specific calcium ligand linked to activation. The reduction in microglial activation was coupled to significant improvement in RGC axonal transport, as measured by neuronal retrograde tracing from the superior colliculus. Finally, minocycline treatment significantly decoupled RGC axon loss from increased intraocular pressure. conclusions. These observations suggest that in glaucoma, retina and optic nerve head microglia activation may be a factor in the early decline in function of the optic nerve and its subsequent degeneration.

Little is known about molecular changes occurring within retinal ganglion cells (RGCs) before their death in glaucoma. Taking advantage of the fact that γ-synuclein (Sncg) mRNA is expressed specifically and highly in adult mouse RGCs, we show in the DBA/2J mouse model of glaucoma that there is not only a loss of cells expressing this gene, but also a downregulation of gene expression of Sncg and many other genes within large numbers of RGCs. This downregulation of gene expression within RGCs occurs together with reductions in FluoroGold (FG) retrograde transport. Surprisingly, there are also large numbers of Sncg-expressing cells without any FG labeling, and among these many that have a marker previously associated with disconnected RGCs, accumulation of phosphorylated neurofilaments in their somas. These same diseased retinas also have large numbers of RGCs that maintain the intraocular portion while losing the optic nerve portion of their axons, and these disconnected axons terminate within the optic nerve head. Our data support the view that RGC degeneration in glaucoma has two separable stages: the first involves atrophy of RGCs, whereas the second involves an insult to axons, which causes the degeneration of axon portions distal to the optic nerve head but does not cause the immediate degeneration of intraretinal portions of axons or the immediate death of RGCs.

Abstract Metabolites, lipids, and other small molecules are key constituents of tissues supporting cellular programs in health and disease. Here, we present METASPACE, a community-populated knowledge base of spatial metabolomes from imaging mass spectrometry data. METASPACE is enabled by a high-performance engine for metabolite annotation in a confidence-controlled way that makes results comparable between experiments and laboratories. By sharing their results publicly, engine users continuously populate a knowledge base of annotated spatial metabolomes in tissues currently including over 3000 datasets from human cancer cohorts, whole-body sections of animal models, and various organs. The spatial metabolomes can be visualized, explored and shared using a web app as well as accessed programmatically for large-scale analysis. By using novel computational methods inspired by natural language processing, we illustrate that METASPACE provides molecular coverage beyond the capacity of any individual laboratory and opens avenues towards comprehensive metabolite atlases on the levels of tissues and organs.

Microglia, the parenchymal macrophage of the central nervous system serve crucial remodeling functions throughout development. Microglia are transcriptionally heterogenous, suggesting that distinct microglial states confer discrete roles. Currently, little is known about how dynamic these states are, the cues that promote them, or how they impact microglial function. In the developing retina, we previously found a significant proportion of microglia express CD11c (Integrin αX, complement receptor 4,

Abstract Microglia serve critical remodeling roles that shape the developing nervous system, responding to the changing neural environment with phagocytosis or soluble factor secretion. Recent single-cell sequencing (scRNAseq) studies have revealed the context-dependent diversity in microglial properties and gene expression, but the cues promoting this diversity are not well defined. Here, we ask how interactions with apoptotic neurons shape microglial state, including lysosomal and lipid metabolism gene expression and independence from Colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) for survival. Using early postnatal mouse retina, a CNS region undergoing significant developmental remodeling, we performed scRNAseq on microglia from mice that are wild-type, lack neuronal apoptosis (Bax KO), or are treated with CSF1R inhibitor (PLX3397). We find that interactions with apoptotic neurons drives multiple microglial remodeling states, subsets of which are resistant to CSF1R inhibition. We find that TAM receptor Mer and complement receptor 3 are required for clearance of apoptotic neurons, but that Mer does not drive expression of remodeling genes. We show TAM receptor Axl is negligible for phagocytosis or remodeling gene expression but is consequential for microglial survival in the absence of CSF1R signaling. Thus, interactions with apoptotic neurons shift microglia towards distinct remodeling states and through Axl, alters microglial dependence on survival pathway, CSF1R.

ABSTRACT Retinal ganglion cells (RGCs) are the projection neurons of the retina. In early retinal progenitor cells (RPCs), Atoh7 orchestrates the developmental RGC program and regulates the expression of critical downstream targets, including Pou4f factors. The absence of Pou4f2 or more POU4F family genes results in defects in RGC differentiation, aberrant axonal elaboration and ultimately RGC death, confirming the requirement of POU4F factors for RGC development and survival, with a critical role in regulating RGC axon outgrowth and pathfinding. Here, we investigated in vivo whether ectopic Pou4f2 expression in late retinal progenitor cells (late RPCs) is sufficient to induce the generation of cells with RGC properties, including projecting axons to the brain. Using a strong ubiquitous promoter to induce Pou4f2 overexpression in neonates, we observed a change in targeted cell distribution in the retinal tissue, including the presence of cells in the ganglion cell layer and inner plexiform layer with high density of GFP + processes along the retina. Similar results on the induction of neuron processes were obtained when we overexpressed Pou4f2 in Atoh7 knockout mice, suggesting that POU4F2 is sufficient to induce them. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis shows that several RGC-genes (such as Rbpms , Gap - 43 , Hs6st3 , and Foxp2 ) are upregulated after Pou4f2 overexpression. Additionally, gene ontology analysis indicates the induction of genes related to axonogenesis and neuronal differentiation. Imaging throughout the visual pathway revealed high density of axons projecting toward the optic nerve head and extending to brain regions, such as the superior colliculus and geniculate nucleus. Thus, Pou4f2 induced neurons with specific RGC characteristics that share similarities with resident RGCs and notably project axons that reach brain targets. In conclusion, these results showed that POU4F2 alone was sufficient to promote critical properties of projection neurons from retinal progenitors outside their developmental window.

Dysregulation of the complement system is implicated in neurodegeneration, including human and animal glaucoma. Optic nerve and retinal damage in glaucoma is preceded by local complement upregulation and activation, but whether targeting this early innate immune response could have therapeutic benefit remains undefined. Because complement signals through three pathways that intersect at complement C3 activation, here we targeted this step to restore complement balance in the glaucomatous retina, and to determine its contribution to degeneration onset and/or progression. To achieve this, we combined adeno-associated viral retinal gene therapy with the targeted C3 inhibitor CR2-Crry. We show that intravitreal injection of AAV2.CR2-Crry produced sustained Crry overexpression in the retina, and reduced deposition of the activation product complement C3d on retinal ganglion cells and the inner retina of DBA/2J mice. This resulted in neuroprotection of retinal ganglion cell axons and somata despite continued intraocular pressure elevation, suggesting a direct restriction of neurodegeneration onset and progression, and significant delay to terminal disease stages. Our study uncovers a damaging effect of complement C3 or downstream complement activation in glaucoma and establishes AAV2.CR2-Crry as a viable therapeutic strategy to target pathogenic C3-mediated complement activation in the glaucomatous retina.

ABSTRACT Microglia, the parenchymal macrophage of the central nervous system, serve crucial remodeling functions throughout development. Microglia are transcriptionally heterogenous, suggesting that distinct microglial states confer discrete roles. Currently, little is known about how dynamic these states are, the cues that promote them, or how they impact microglial function. In the developing retina, we previously found a significant proportion of microglia express CD11c (Integrin αX, Itgax, subunit of complement receptor 4) which has also been reported in other developmental and disease contexts. Here, we sought to understand the regulation and function of CD11c+ microglia. We found that CD11c+ microglia track with prominent waves of neuronal apoptosis in postnatal retina. Using genetic fate mapping, we provide evidence that microglia transition out of the CD11c state to return to homeostasis. We show that CD11c+ microglia have elevated lysosomal content and contribute to the clearance of apoptotic neurons, and found that acquisition of CD11c expression is partially dependent upon the TAM receptor AXL. Using selective ablation, we found CD11c+ microglia are not uniquely critical for phagocytic clearance of apoptotic cells. Together, our data suggest that CD11c+ microglia are a transient state induced by developmental apoptosis rather than a specialized subset mediating phagocytic elimination.