LC3-associated phagocytosis (LAP) is a process wherein elements of autophagy conjugate LC3 to phagosomal membranes. We characterize the molecular requirements for LAP, and identify Rubicon as being required for LAP but not autophagy. Rubicon is recruited to LAPosomes and is required for the activity of a Class III PI(3)K complex containing UVRAG but lacking ATG14 and Ambra1. This allows for the sustained localization of PtdIns(3)P, which is critical for recruitment of downstream autophagic proteins and stabilization of the NOX2 complex to produce reactive oxygen species. Both PtdIns(3)P and reactive oxygen species are required for conjugation of LC3 to LAPosomes and subsequent association with LAMP1+ lysosomes. LAP is induced by engulfment of Aspergillus fumigatus, a fungal pathogen that commonly afflicts immunocompromised hosts, and is required for its optimal clearance in vivo. Therefore, we have identified molecules that distinguish LAP from canonical autophagy, thereby elucidating the importance of LAP in response to A. fumigatus infection. Green and colleagues characterize LC3-associated phagocytosis as a process that depends on Rubicon, Beclin-1, UVRAG and VPS34 but not on canonical autophagy proteins.

Identification of host genes essential for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection may reveal novel therapeutic targets and inform our understanding of coronavirus disease 2019 (COVID-19) pathogenesis. Here we performed genome-wide CRISPR screens in Vero-E6 cells with SARS-CoV-2, Middle East respiratory syndrome CoV (MERS-CoV), bat CoV HKU5 expressing the SARS-CoV-1 spike, and vesicular stomatitis virus (VSV) expressing the SARS-CoV-2 spike. We identified known SARS-CoV-2 host factors, including the receptor ACE2 and protease Cathepsin L. We additionally discovered pro-viral genes and pathways, including HMGB1 and the SWI/SNF chromatin remodeling complex, that are SARS lineage and pan-coronavirus specific, respectively. We show that HMGB1 regulates ACE2 expression and is critical for entry of SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, and NL63. We also show that small-molecule antagonists of identified gene products inhibited SARS-CoV-2 infection in monkey and human cells, demonstrating the conserved role of these genetic hits across species. This identifies potential therapeutic targets for SARS-CoV-2 and reveals SARS lineage-specific and pan-CoV host factors that regulate susceptibility to highly pathogenic CoVs.

Defects in LC3-associated phagocytosis in mice are shown to result in systemic lupus erythematosus-like disease; dying cells are engulfed but not degraded in LAP-deficient mice, resulting in increased serum levels of autoantibodies and inflammatory cytokines, and evidence of kidney disease. Jennifer Martinez et al. provide evidence that defects in LC3-associated phagocytosis in mice result in a condition resembling the autoimmune disease systemic lupus erythematosus. Dying cells are engulfed but not degraded in mice deficient in LC3-associated phagocytosis, resulting in elevated serum anti-DNA antibodies, inflammatory cytokines, and kidney disease. The effect is independent of canonical autophagy. These findings suggest a link between the clearance of dying cells, autophagic processes, and inflammation in the control of systemic lupus erythematosus. Defects in clearance of dying cells have been proposed to underlie the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE)1. Mice lacking molecules associated with dying cell clearance develop SLE-like disease2, and phagocytes from patients with SLE often display defective clearance and increased inflammatory cytokine production when exposed to dying cells in vitro. Previously, we3,4,5,6 and others7 described a form of noncanonical autophagy known as LC3-associated phagocytosis (LAP), in which phagosomes containing engulfed particles, including dying cells3,4,7, recruit elements of the autophagy pathway to facilitate maturation of phagosomes and digestion of their contents. Genome-wide association studies have identified polymorphisms in the Atg5 (ref. 8) and possibly Atg7 (ref. 9) genes, involved in both canonical autophagy and LAP3,4,5,6,7, as markers of a predisposition for SLE. Here we describe the consequences of defective LAP in vivo. Mice lacking any of several components of the LAP pathway show increased serum levels of inflammatory cytokines and autoantibodies, glomerular immune complex deposition, and evidence of kidney damage. When dying cells are injected into LAP-deficient mice, they are engulfed but not efficiently degraded and trigger acute elevation of pro-inflammatory cytokines but not anti-inflammatory interleukin (IL)-10. Repeated injection of dying cells into LAP-deficient, but not LAP-sufficient, mice accelerated the development of SLE-like disease, including increased serum levels of autoantibodies. By contrast, mice deficient in genes required for canonical autophagy but not LAP do not display defective dying cell clearance, inflammatory cytokine production, or SLE-like disease, and, like wild-type mice, produce IL-10 in response to dying cells. Therefore, defects in LAP, rather than canonical autophagy, can cause SLE-like phenomena, and may contribute to the pathogenesis of SLE.

New insights into norovirus entry There's no escaping norovirus when you have it—the symptoms from this gastroenteritis-causing virus, though brief, are often debilitating. Preventing infections will rely on improving our understanding of how norovirus enters host cells. Orchard et al. show that the entry of murine norovirus (MNoV) into host cells requires a protein called CD300lf. In cell culture, mouse cells needed to express CD300lf in order for MNoV binding, entry, and replication to occur. Deleting the gene encoding CD300lf in mice protected them against MNoV infection. Human cells expressing CD300lf allowed MNoV to break the species barrier, a finding that may lead to new insights into the infectivity of this virus. Science , this issue p. 933

Aiding and abetting norovirus disease Norovirus is highly infectious and usually causes transient, acute disease. In some individuals, norovirus persists and is associated with inflammatory bowel disorders. While investigating the cell tropism for murine norovirus, Wilen et al. discovered that a rare cell type, tuft cells, carrying the CD300lf receptor were the virus's specific target. Tuft cells proliferate in response to the type 2 cytokines interleukin-4 and interleukin-25, which thereby amplify norovirus infection. Moreover, infected tuft cells are resistant to immune clearance. This effect may explain the associated persistent disease symptoms that humans can suffer. Science , this issue p. 204

Abstract Noroviruses (NoVs) are a leading cause of gastroenteritis world-wide, yet host factors that restrict NoV replication are not well understood. Here, we use a CRISPR activation (CRISPRa) genome-wide screening to identify host genes that can inhibit murine norovirus (MNoV) replication in either mouse or human cells. Our screens identified with high confidence 57 genes that can inhibit MNoV infection when overexpressed. A significant number of these genes are in interferon and immune regulation signaling networks, but surprising, the majority of the genes identified are not associated with innate or adaptive immunity nor with any antiviral activity. Confirmatory studies of eight of the genes in validate the initial screening data. Mechanistic studies on TRIM7 demonstrated a conserved role of the molecule in mouse and human cells in restricting MNoV in a step of infection after viral entry. Furthermore, we demonstrate that two isoforms of TRIM7 have differential antiviral activity. Taken together these data provide a resource for understanding norovirus biology and demonstrate a robust methodology for identifying new antiviral molecules across cell types and species. Author Summary Norovirus is one of the leading causes of foodborne illness world-wide. Despite its prevalence, our understanding of norovirus biology is limited due to the difficulty in growing human norovirus in vitro and a lack of an animal model. Murine norovirus (MNoV) is a model norovirus system because MNoV replicates robustly in cell culture and in mice. To identify host genes that can restrict norovirus replication when overexpressed we performed genome-wide CRISPR activation (CRISPRa) screens to induce gene overexpression at the native locus through recruitment of transcriptional activators to individual gene promoters. We found 57 genes could block murine norovirus replication in either mouse or human cells. Several of these genes are associated with classical immune signaling pathways, while many of the molecules we identified have not been previously associated with antiviral activity. Our data is a resource for those studying norovirus and we provide a robust approach to identify novel antiviral genes.

Abstract Cholesterol homeostasis is required for the replication of many viruses, including Ebola virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus-1. Niemann-Pick C1 (NPC1) is an endosomal-lysosomal membrane protein involved in cholesterol trafficking from late endosomes and lysosomes to the endoplasmic reticulum. We identified NPC1 in CRISPR and RNA interference screens as a putative host factor for infection by mammalian orthoreovirus (reovirus). Following internalization via clathrin-mediated endocytosis, the reovirus outer capsid is proteolytically removed, the endosomal membrane is disrupted, and the viral core is released into the cytoplasm where viral transcription, genome replication, and assembly take place. We found that reovirus infection is significantly impaired in cells lacking NPC1, but infection is restored by treatment of cells with hydroxypropyl-β-cyclodextrin, which binds and solubilizes cholesterol. Absence of NPC1 did not dampen infection by infectious subvirion particles, which are reovirus disassembly intermediates that bypass the endocytic pathway for infection of target cells. NPC1 is not required for reovirus attachment to the plasma membrane, internalization into cells, or uncoating within endosomes. Instead, NPC1 is required for delivery of transcriptionally active reovirus core particles into the cytoplasm. These findings suggest that cholesterol homeostasis, ensured by NPC1 transport activity, is required for reovirus penetration into the cytoplasm, pointing to a new function for NPC1 and cholesterol homeostasis in viral infection. Author summary Genetic screens are useful strategies to identify host factors required for viral infection. NPC1 was identified in independent CRISPR and RNA interference screens as a putative host factor required for reovirus replication. We discovered that NPC1-mediated cholesterol transport is dispensable for reovirus attachment, internalization, and disassembly but required for penetration of the viral disassembly intermediate from late endosomes into the cytoplasm. These findings pinpoint an essential function for cholesterol in the entry of reovirus and raise the possibility that cholesterol homeostasis regulates the entry of other viruses that penetrate late endosomes to initiate replication.

ABSTRACT Noroviruses are a leading cause of gastrointestinal infection in humans and mice. Understanding human norovirus (HuNoV) cell tropism has important implications for our understanding of viral pathogenesis. Murine norovirus (MNoV) is extensively used as a surrogate model for HuNoV. We previously identified CD300lf as the receptor for MNoV. Here, we generated a Cd300lf conditional knockout ( CD300lf F/F ) mouse to elucidate the cell tropism of persistent and non-persistent strains of murine norovirus. Using this mouse model, we demonstrate that CD300lf expression on intestinal epithelial cells (IECs), and on tuft cells in particular, is essential for transmission of the persistent MNoV strain CR6 (MNoV CR6 ) in vivo . In contrast, the nonpersistent MNoV strain CW3 (MNoV CW3 ) does not require CD300lf expression on IECs for infection. However, deletion of CD300lf in myelomonocytic cells ( LysM Cre+) partially reduces CW3 viral load in lymphoid and intestinal tissues. Disruption of CD300lf expression on B cells ( CD19 Cre ), neutrophils ( Mrp8 Cre ), and dendritic cells ( CD11c Cre ) did not affect CW3 viral RNA levels. Finally, we show that the transcription factor STAT1, which is critical for the innate immune response, partially restricts the cell tropism of MNoV CW3 to LysM+ cells. Taken together, these data demonstrate that CD300lf expression on tuft cells is essential for MNoV CR6 , that myelomonocytic cells are a major, but not exclusive, target cell of MNoV CW3 , and that STAT1 signaling restricts the cellular tropism of MNoV CW3 . This provides the first genetic system to study the cell type-specific role of CD300lf in norovirus pathogenesis. IMPORTANCE Human noroviruses (HuNoVs) are a leading cause of gastroenteritis resulting in up to 200,000 deaths each year. The receptor and cell tropism of HuNoV in immunocompetent humans are unclear. We use murine norovirus (MNoV) as a model for HuNoV. We recently identified CD300lf as the sole physiologic receptor for MNoV. Here, we leverage this finding to generate a Cd300lf conditional knockout mouse to decipher the contributions of specific cell types to MNoV infection. We demonstrate that persistent MNoV CR6 requires CD300lf expression on tuft cells. In contrast, multiple CD300lf+ cell types, dominated by myelomonocytic cells, are sufficient for non-persistent MNoV CW3 infection. CD300lf expression on epithelial cells, B cells, neutrophils, and dendritic cells is not critical for MNoV CW3 infection. Mortality associated with MNoV CW3 strain in Stat1 -/- mice does not require CD300lf expression on LysM+ cells, highlighting that both CD300lf receptor expression and innate immunity regulate MNoV cell tropism in vivo .

The FACT complex is an ancient chromatin remodeling factor comprised of Spt16 and SSRP1 subunits that regulates specific eukaryotic gene expression programs. However, whether FACT regulates host immune responses to infection was unclear. Here, we identify an antiviral pathway mediated by FACT, distinct from the interferon response, that restricts poxvirus replication. We show that early viral gene expression triggers nuclear accumulation of specialized, SUMOylated Spt16 subunits of FACT required for expression of ETS-1, a downstream transcription factor that activates a virus restriction program. However, poxvirus-encoded A51R proteins block ETS-1 expression by outcompeting SSRP1 for binding to SUMOylated Spt16 in the cytosol and by tethering SUMOylated Spt16 to microtubules. Moreover, we show that A51R antagonism of FACT enhances both poxvirus replication in human cells and viral virulence in mice. Finally, we demonstrate that FACT also restricts unrelated RNA viruses, suggesting a broad role for FACT in antiviral immunity. Our study reveals the F ACT- E TS-1 A ntiviral R esponse (FEAR) pathway to be critical for eukaryotic antiviral immunity and describes a unique mechanism of viral immune evasion.