The mode of acquisition and causes for the variable clinical spectrum of coronavirus disease 2019 (COVID-19) remain unknown. We utilized a reverse genetics system to generate a GFP reporter virus to explore severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pathogenesis and a luciferase reporter virus to demonstrate sera collected from SARS and COVID-19 patients exhibited limited cross-CoV neutralization. High-sensitivity RNA in situ mapping revealed the highest angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) expression in the nose with decreasing expression throughout the lower respiratory tract, paralleled by a striking gradient of SARS-CoV-2 infection in proximal (high) versus distal (low) pulmonary epithelial cultures. COVID-19 autopsied lung studies identified focal disease and, congruent with culture data, SARS-CoV-2-infected ciliated and type 2 pneumocyte cells in airway and alveolar regions, respectively. These findings highlight the nasal susceptibility to SARS-CoV-2 with likely subsequent aspiration-mediated virus seeding to the lung in SARS-CoV-2 pathogenesis. These reagents provide a foundation for investigations into virus-host interactions in protective immunity, host susceptibility, and virus pathogenesis.

The spike aspartic acid-614 to glycine (D614G) substitution is prevalent in global severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) strains, but its effects on viral pathogenesis and transmissibility remain unclear. We engineered a SARS-CoV-2 variant containing this substitution. The variant exhibits more efficient infection, replication, and competitive fitness in primary human airway epithelial cells but maintains similar morphology and in vitro neutralization properties, compared with the ancestral wild-type virus. Infection of human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) transgenic mice and Syrian hamsters with both viruses resulted in similar viral titers in respiratory tissues and pulmonary disease. However, the D614G variant transmits significantly faster and displayed increased competitive fitness than the wild-type virus in hamsters. These data show that the D614G substitution enhances SARS-CoV-2 infectivity, competitive fitness, and transmission in primary human cells and animal models.

Rationale: E-cigarettes vaporize propylene glycol/vegetable glycerin (PG/VG), nicotine, and flavorings. However, the long-term health effects of exposing lungs to vaped e-liquids are unknown.Objectives: To determine the effects of chronic vaping on pulmonary epithelia.Methods: We performed research bronchoscopies on healthy nonsmokers, cigarette smokers, and e-cigarette users (vapers) and obtained bronchial brush biopsies and lavage samples from these subjects for proteomic investigation. We further employed in vitro and murine exposure models to support our human findings.Measurements and Main Results: Visual inspection by bronchoscopy revealed that vaper airways appeared friable and erythematous. Epithelial cells from biopsy samples revealed approximately 300 proteins that were differentially expressed in smoker and vaper airways, with only 78 proteins being commonly altered in both groups and 113 uniquely altered in vapers. For example, CYP1B1 (cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1), MUC5AC (mucin 5 AC), and MUC4 levels were increased in vapers. Aerosolized PG/VG alone significantly increased MUC5AC protein in human airway epithelial cultures and in murine nasal epithelia in vivo. We also found that e-liquids rapidly entered cells and that PG/VG reduced membrane fluidity and impaired protein diffusion.Conclusions: We conclude that chronic vaping exerts marked biological effects on the lung and that these effects may in part be mediated by the PG/VG base. These changes are likely not harmless and may have clinical implications for the development of chronic lung disease. Further studies will be required to determine the full extent of vaping on the lung.

Abstract The D614G substitution in the S protein is most prevalent SARS-CoV-2 strain circulating globally, but its effects in viral pathogenesis and transmission remain unclear. We engineered SARS-CoV-2 variants harboring the D614G substitution with or without nanoluciferase. The D614G variant replicates more efficiency in primary human proximal airway epithelial cells and is more fit than wildtype (WT) virus in competition studies. With similar morphology to the WT virion, the D614G virus is also more sensitive to SARS-CoV-2 neutralizing antibodies. Infection of human ACE2 transgenic mice and Syrian hamsters with the WT or D614G viruses produced similar titers in respiratory tissue and pulmonary disease. However, the D614G variant exhibited significantly faster droplet transmission between hamsters than the WT virus, early after infection. Our study demonstrated the SARS-CoV2 D614G substitution enhances infectivity, replication fitness, and early transmission.

Abstract Cell therapy is a potential treatment for cystic fibrosis (CF). However, cell engraftment into the airway epithelium is challenging. Here, we model cell engraftment in vitro using the air-liquid interface (ALI) culture system by injuring well-differentiated CF ALI cultures and delivering non-CF cells at the time of peak injury. Engraftment efficiency was quantified by measuring chimerism by droplet digital PCR and functional ion transport in Ussing chambers. Using this model, we found that human bronchial epithelial cells (HBECs) engraft more efficiently when they are cultured by conditionally reprogrammed cell (CRC) culture methods. Cell engraftment into the airway epithelium requires airway injury, but the extent of injury needed is unknown. We compared three injury models and determined that severe injury with partial epithelial denudation facilitates long-term cell engraftment and functional CFTR recovery up to 20% of wildtype function. The airway epithelium promptly regenerates in response to injury, creating competition for space and posing a barrier to effective engraftment. We examined competition dynamics by time-lapse confocal imaging and found that delivered cells accelerate airway regeneration by incorporating into the epithelium. Irradiating the repairing epithelium granted engrafting cells a competitive advantage by diminishing resident stem cell proliferation. Intentionally causing severe injury to the lungs of people with CF would be dangerous. However, naturally occurring events like viral infection can induce similar epithelial damage with patches of denuded epithelium. We found that viral preconditioning promoted effective engraftment of cells primed for viral resistance.

Abstract With the approval of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (trade name Trikafta), the vast majority of people with cystic fibrosis (CF) are eligible for CF transmembrane conductance regulator (CFTR) modulator therapy. Remaining individuals have premature termination codons or rare CFTR variants with limited treatment options. Although clinical modulator response can be reliably predicted using primary airway epithelial cells, primary cells carrying rare CFTR variants are scarce. To overcome this obstacle, these cells can be expanded by overexpression of mouse Bmi-1 and human TERT (hTERT). We therefore used this approach to develop two non-CF and three CF (F508del/F508del, F508del/S492F, W1282X/W1282X) nasal cell lines and two W1282X/W1282X bronchial cell lines. Bmi-1/hTERT cell lines recapitulated primary cell morphology and ion transport function. The F508del/F508del and F508del/S492F cell lines robustly responded to Trikafta, which was mirrored in the parent primary cells and the cell donors’ clinical response. CC-90009, a novel cereblon E3 ligase modulator targeting the GSPT1 protein, rescued ~20% of wildtype CFTR function in our panel of W1282X/W1282X cell lines and primary cells. Intriguingly, CC-90009 also diminished epithelial sodium channel function. These studies demonstrate that Bmi-1/hTERT cell lines faithfully mirror primary cell responses to CFTR modulators and illustrate novel therapeutic approaches for the W1282X CFTR variant.