Abstract Neurodegeneràve diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are oten associated with mutàons in proteins that are associated with stress granules. Stress granules are condensates formed by liquid-liquid phase separàon which, when aberrant, can lead to altered condensàon behaviours and disease phenotypes. Here, we identified lipoamide, a small molecule which specifically prevents cytoplasmic condensàon of stress granule proteins. Thermal proteome profiling showed that lipoamide preferentially stabilises intrinsically disordered domain-containing proteins. These include SRSF1 and SFPQ, stress granule proteins necessary for lipoamide activity. The redox state of SFPQ correlates with its condensate-dissolving behaviour, in concordance with the importance of the dithiolane ring for lipoamide activity. In animals, lipoamide ameliorates aging-associated aggregàon of a stress granule reporter, improves neuronal morphology, and recovers motor defects caused by expression of ALS-associated FUS and TDP-43 mutants. In conclusion, lipoamide is a well-tolerated small molecule modulator of stress granule condensàon and dissection of its molecular mechanism identified a cellular pathway for redox regulàon of stress granule formàon.

Abstract Eukaryotic cells produce over 1000 different lipid species which tune organelle membrane properties, control signalling and store energy 1,2 . How lipid species are selectively sorted between organelles to maintain specific membrane identities is largely unknown due to the difficulty to image lipid transport in cells 3 . Here, we measured transport and metabolism of individual lipid species in mammalian cells using time-resolved fluorescence imaging of bifunctional lipid probes in combination with ultra-high resolution mass spectrometry and mathematical modelling. Quantification of lipid flux between organelles revealed that directional, non-vesicular lipid transport is responsible for fast, species-selective lipid sorting compared to slow, unspecific vesicular membrane trafficking. Using genetic perturbations, we found that coupling between active lipid flipping and passive non-vesicular transport is a mechanism for directional lipid transport. Comparison of metabolic conversion and transport rates showed that non-vesicular transport dominates the organelle distribution of lipids while species-specific phospholipid metabolism controls neutral lipid accumulation. Our results provide the first quantitative map of retrograde lipid flux in cells 4 . We anticipate that our pipeline for quantitative mapping of lipid flux through physical and chemical space in cells will boost our understanding of lipids in cell biology and disease.

Abstract Recent progress in glycan research has been driven by widespread implementations of metabolic oligosaccharide engineering. Complementing existing approaches, we here introduce bifunctional, UV-crosslinkable and clickable N-acetylglucosamine and N-acetylgalactosamine analogues, which enable direct visualization of the intracellular probe distribution as well as distinguishing monomeric and macromolecule-bound fractions. Using this feature, we find that monomeric N-acetylmonosaccharides partition into RNA-rich nuclear compartments such as nuclear speckles and nucleoli. This suggests the existence of spatially separated N-acetylmonosccharide pools within the nucleoplasm. Taken together, bifunctional N-acetylmonosaccharide probes are a powerful discovery tool for probing intracellular localization of monosaccharides and glycosylated macromolecules.

Abstract Studying the role of molecularly distinct lipid species in cell signaling remains challenging due to a scarcity of methods for performing quantitative lipid biochemistry in living cells. We have recently used lipid uncaging to quantify lipid-protein affinities and rates of lipid transbilayer movement and turnover in the diacylglycerol signaling pathway using population average time series data. So far, this approach does not allow to account for the cell-to-cell variability of cellular signaling responses. We here report a framework that allows to uniquely identify model parameters such diacylglycerol-protein affinities and transbilayer movement rates at the single cell level for a broad variety of structurally different diacylglycerol species. We find that lipid unsaturation degree and longer side chains generally correlate with faster lipid transbilayer movement and turnover and higher lipid-protein affinities. In summary, our work demonstrates how rate parameters and lipid-protein affinities can be quantified from single cell signaling trajectories with sufficient sensitivity to resolve the subtle kinetic differences caused by the chemical diversity of cellular signaling lipid pools.

Every cell produces thousands of distinct lipid species, but methodology for studying the biological roles of individual lipids is insufficient. Using the example of diacylglycerols, prominent second messengers, we here investigate whether lipid chemical diversity can provide a basis for cellular signal specification. We developed novel photo-caged lipid probes, which allow acute manipulation of distinct diacylglycerol species in the plasma membrane. Combining uncaging experiments with mathematical modelling enabled the determination of binding constants for diacylglycerol-protein interactions and kinetic parameters for diacylglycerol transbilayer movement and turnover in quantitative live-cell experiments. Strikingly, we find that affinities and kinetics vary by orders of magnitude due to diacylglycerol structural diversity. These differences are sufficient to explain differential recruitment of diacylglycerol binding proteins and thus differing downstream phosphorylation patterns. Our approach represents a generally applicable method for elucidating the biological function of single lipid species on subcellular scales.

Abstract Ether glycerophospholipids bear a long chain alcohol attached via an alkyl or vinyl ether bond at the sn1 position of the glycerol backbone. Emerging evidence suggests that ether lipids play a significant role in physiology and human health but their precise cellular functions remain largely unknown. Here, we introduce bifunctional ether lipid probes bearing diazirine and alkyne groups to study ether lipid biology. To interrogate the kinetics of intracellular ether lipid transport in mammalian cells we used a combination of fluorescence imaging, machine learning-assisted image analysis and mathematical modelling. We find that alkyl-linked ether lipids are transported up to twofold faster than vinyl-linked plasmalogens, suggesting that the lipid transport machinery can distinguish between linkage types differing by as little as two hydrogen atoms. We find that ether lipid transport predominantly occurs via non-vesicular pathways, with varying contributions from vesicular mechanisms between cell types. Altogether, our results suggest that differential recognition of alkyl- and vinyl ether lipids by lipid transfer proteins contributes to their distinct biological functions. In the future, the probes reported here will enable studying ether lipid biology in much greater detail through identification of interacting proteins and in-depth characterization of intracellular ether lipid dynamics.

ABSTRACT Energy production and utilization is critically important for animal development and growth. How it is regulated in space and time during tissue growth remains largely unclear. Toward this end, we used a FRET-based adenosine triphosphate (ATP) sensor to dynamically monitor ATP levels across a growing tissue, using the Drosophila wing disc. We discovered that steady-state levels of ATP are spatially uniform across the wing pouch. Pharmacologically inhibiting oxidative phosphorylation, however, reveals spatial heterogeneities in metabolic behavior, whereby signaling centers at compartment boundaries produce more ATP from glycolysis than the rest of the tissue. Genetic perturbations indicate that the conserved Hedgehog (Hh) signaling pathway can enhance ATP production by glycolysis. Collectively, our work reveals a positive feedback loop between Hh signaling and energy metabolism, advancing our understanding of the connection between conserved developmental patterning genes and energy production during animal tissue development.