Drug discovery campaigns against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) are beginning to target the viral RNA genome 1, 2 . The frameshift stimulation element (FSE) of the SARS-CoV-2 genome is required for balanced expression of essential viral proteins and is highly conserved, making it a potential candidate for antiviral targeting by small molecules and oligonucleotides 3-6 . To aid global efforts focusing on SARS-CoV-2 frameshifting, we report exploratory results from frameshifting and cellular replication experiments with locked nucleic acid (LNA) antisense oligonucleotides (ASOs), which support the FSE as a therapeutic target but highlight difficulties in achieving strong inactivation. To understand current limitations, we applied cryogenic electron microscopy (cryo-EM) and the Ribosolve 7 pipeline to determine a three-dimensional structure of the SARS-CoV-2 FSE, validated through an RNA nanostructure tagging method. This is the smallest macromolecule (88 nt; 28 kDa) resolved by single-particle cryo-EM at subnanometer resolution to date. The tertiary structure model, defined to an estimated accuracy of 5.9 Å, presents a topologically complex fold in which the 5' end threads through a ring formed inside a three-stem pseudoknot. Our results suggest an updated model for SARS-CoV-2 frameshifting as well as binding sites that may be targeted by next generation ASOs and small molecules.

Accurate assessments of current and future fertility-including overall trends and changing population age structures across countries and regions-are essential to help plan for the profound social, economic, environmental, and geopolitical challenges that these changes will bring. Estimates and projections of fertility are necessary to inform policies involving resource and health-care needs, labour supply, education, gender equality, and family planning and support. The Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) 2021 produced up-to-date and comprehensive demographic assessments of key fertility indicators at global, regional, and national levels from 1950 to 2021 and forecast fertility metrics to 2100 based on a reference scenario and key policy-dependent alternative scenarios.

Abstract Background Galli gigeriae endothelium corneum (GGEC) has been effectively used for centuries for the treatment of functional dyspepsia (FD) in clinical practice in Asian countries. However, its potential mechanism and chemical composition remains undertermined. Methods In this study, the chemical profile of GGEC ethyl acetate extract (EAE) was evaluated by HPLC-Q-TOF–MS/MS. The effects of EAE on intestinal barrier function and inflammation were investigated in IEC-6 cells and RAW264.7 cells. Results The results showed that 33 compounds were tentatively identified, including 12 soy isoflavones, 7 bile acids for the first time in EAE. EAE significantly reinforced intestinal barrier function via increasing the tight junction protein levels of ZO-1 and Occludin, reducing the mRNA expression levels of interleukin (IL)-1β and IL-6 in tumor necrosis factor alpha (TNF-α)-challenged IEC-6 cells. The scratch wound assay showed that EAE accelerated wound healing of IEC-6 cells. EAE evidently reduced the level of NO in a dose-dependent manner with an IC 50 value of 18.12 μg/mL, and the mRNA expression of TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS and COX-2 in LPS-treated RAW264.7 cells. Conclusion This study revealed the intestinal barrier protective effects and chemical profile of GGEC, and the results indicated that GGEC strengthened the intestinal barrier by up-regulating protein expression of tight junctions and limiting inflammatory responses.

Abstract Breakthroughs in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) technology have made near-atomic resolution structure determination possible. Here, we report a ∼1.35-Å structure of apoferritin reconstructed from images recorded on a Gatan K3 or a Thermo Fisher Falcon 4 detector in a commonly available 300-kV Titan Krios microscope (G3i) equipped with or without a Gatan post-column energy filter. Our results demonstrate that the atomic-resolution structure determination can be achieved by single-particle cryo-EM with a fraction of a day of automated data collection. These structures resolve unambiguously each heavy atom (C, N, O, and S) in the amino acid side chains with an indication of hydrogen atoms’ presence and position, as well as the unambiguous existence of multiple rotameric configurations for some residues. We also develop a statistical and chemical based protocol to assess the positions of the water molecules directly from the cryo-EM map. In addition, we have introduced a B’ factor equivalent to the conventional B factor traditionally used by crystallography to annotate the atomic resolution model for determined structures. Our findings will be of immense interest among protein and medicinal scientists engaging in both basic and translational research.

Abstract The Lon AAA+ (adenosine triphosphatases associated with diverse cellular activities) protease (LonA) converts ATP-fuelled conformational changes into sufficient mechanical force to drive translocation of the substrate into a hexameric proteolytic chamber. To understand the structural basis for the substrate translocation process, we have determined the cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of Meiothermus taiwanensis LonA (MtaLonA) at 3.6 Å resolution in a substrate-engaged state. Substrate interactions are mediated by the dual pore-loops of the ATPase domains, organized in spiral staircase arrangement from four consecutive protomers in different ATP-binding and hydrolysis states; a closed AAA+ ring is nevertheless maintained by two disengaged ADP-bound protomers transiting between the lowest and highest position. The structure reveals a processive rotary translocation mechanism mediated by LonA-specific nucleotide-dependent allosteric coordination among the ATPase domains, which is induced by substrate binding.

The long-lasting COVID-19 pandemic and increasing SARS-CoV-2 variants demand effective drugs for prophylactics and treatment. Protein-based biologics offer high specificity yet their noncovalent interactions often lead to drug dissociation and incomplete inhibition. Here we developed covalent nanobodies capable of binding with SARS-CoV-2 spike protein irreversibly via proximity-enabled reactive therapeutic (PERx) mechanism. A novel latent bioreactive amino acid FFY was designed and genetically encoded into nanobodies to accelerate PERx reaction rate. After covalent engineering, nanobodies binding with the Spike in the down state, but not in the up state, were discovered to possess striking enhancement in inhibiting viral infection. In comparison with the noncovalent wildtype nanobody, the FFY-incorporated covalent nanobody neutralized both authentic SARS-CoV-2 and its Alpha and Delta variants with potency drastically increased over tens of folds. This PERx-enabled covalent nanobody strategy and uncovered insights on potency increase can be valuable to developing effective therapeutics for various viral infections.

Human coronavirus NL63 (HCoV-NL63) is an enveloped pathogen of the family Coronaviridae that spreads worldwide and causes up to 10% of all annual respiratory diseases. HCoV-NL63 is typically associated with mild upper respiratory symptoms in children, elderly and immunocompromised individuals. It has also been shown to cause severe lower respiratory illness. NL63 shares ACE2 as a receptor for viral entry with SARS-CoV and SARS-CoV-2. Here we present the in situ structure of HCoV-NL63 spike (S) trimer at 3.4-A resolution by single-particle cryo-EM imaging of vitrified virions without chemical fixative. It is structurally homologous to that obtained previously from the biochemically purified ectodomain of HCoV-NL63 S trimer, which displays a 3-fold symmetric trimer in a single conformation. In addition to previously proposed and observed glycosylation sites, our map shows density at other amino acid positions as well as differences in glycan structures. The domain arrangement within a protomer is strikingly different from that of the SARS-CoV-2 S and may explain their different requirements for activating binding to the receptor. This structure provides the basis for future studies of spike proteins with receptors, antibodies, or drugs, in the native state of the coronavirus particles.

Abstract Precursor ribosomal RNA (pre-rRNA) processing is a key step in ribosome biosynthesis and involves numerous RNases. A HEPN nuclease Las1 and a polynucleotide kinase Grc3 assemble into a tetramerase responsible for rRNA maturation. Here, we report the structures of full-length Saccharomyces cerevisiae and Cyberlindnera jadinii Las1-Grc3 complexes, and Cyberlindnera jadinii Las1. The Las1-Grc3 structures show that the central coiled coil domain of Las1 facilitates pre-rRNA binding and cleavage, while the Grc3 C-terminal loop motif directly binds to the HEPN active center of Las1 and regulates pre-rRNA cleavage. Structural comparison between Las1 and Las1-Grc3 complex exhibits that Grc3 binding induces conformational rearrangements of catalytic residues associated with HEPN nuclease activation. Biochemical assays identify that Las1 processes pre-rRNA at the two specific sites (C2 and C2′), which greatly facilitates rRNA maturation. Our structures and specific pre-rRNA cleavage findings provide crucial insights into the mechanism and pathway of pre-rRNA processing in ribosome biosynthesis.

Abstract Current antidepressants have limitations due to insufficient efficacy and delay before improvement in symptoms. Polymorphisms of the serotonin transporter (5-HTT) gene have been linked to depression (when combined with stressful life events) and to altered response to selective serotonergic reuptake inhibitors. We have previously revealed the antidepressant-like properties of the iron chelator deferiprone in the 5-HTT knock-out (KO) mouse model of depression. Furthermore, deferiprone was found to alter neural activity in the prefrontal cortex of both wild-type (WT) and 5-HTT KO mice. In the current study, we examined the molecular effects of acute deferiprone treatment in the prefrontal cortex of both genotypes via phosphoproteomics. In WT mice treated with deferiprone, there were 22 differentially expressed phosphosites, with gene ontology analysis implicating cytoskeletal proteins. In 5-HTT KO mice treated with deferiprone, we found 33 differentially expressed phosphosites. Gene ontology analyses revealed phosphoproteins that were predominantly involved in synaptic and glutamatergic signalling. In a drug naive cohort, the analysis revealed 21 differentially expressed phosphosites in 5-HTT KO compared to WT mice. We confirmed the deferiprone-induced increase in Tyrosine hydroxylase serine 40 residue phosphorylation (pTH-Ser40) (initially revealed in our phosphoproteomics study) by western blots, with deferiprone increasing pTH-Ser40 expression in WT and 5-HTT KO mice. As glutamatergic and synaptic signalling are dysfunctional in 5-HTT KO mice (and are the target of fast-acting antidepressant drugs such as ketamine), these molecular effects may underpin deferiprone’s antidepressant-like properties. Furthermore, dopaminergic signalling may also be involved in deferiprone’s antidepressant-like properties.

Data-independent acquisition mass spectrometry (DIA-MS) is a rapidly evolving technique that enables relatively deep proteomic profiling with superior quantification reproducibility. DIA data mining predominantly relies on a spectral library of sufficient proteome coverage that, in most cases, is built on data-dependent acquisition-based analysis of the same sample. To expand the proteome coverage for a pre-determined protein family, we report herein on the construction of a hybrid spectral library that supplements a DIA experiment-derived library with a protein family-targeted virtual library predicted by deep learning. Leveraging this DIA hybrid library substantially deepens the coverage of three transmembrane protein families (G protein coupled receptors; ion channels; and transporters) in mouse brain tissues with increases in protein identification of 37-87%, and peptide identification of 58-161%. Moreover, of the 412 novel GPCR peptides exclusively identified with the DIA hybrid library strategy, 53.6% were validated as present in mouse brain tissues based on orthogonal experimental measurement.