The COVID-19 pandemic caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2 has led to accelerated efforts to develop therapeutics, diagnostics, and vaccines to mitigate this public health emergency. A key target of these efforts is the spike (S) protein, a large trimeric class I fusion protein that is metastable and difficult to produce recombinantly in large quantities. Here, we designed and expressed over 100 structure-guided spike variants based upon a previously determined cryo-EM structure of the prefusion SARS-CoV-2 spike. Biochemical, biophysical and structural characterization of these variants identified numerous individual substitutions that increased protein yields and stability. The best variant, HexaPro, has six beneficial proline substitutions leading to ~10-fold higher expression than its parental construct and is able to withstand heat stress, storage at room temperature, and multiple freeze-thaws. A 3.2 Å-resolution cryo-EM structure of HexaPro confirmed that it retains the prefusion spike conformation. High-yield production of a stabilized prefusion spike protein will accelerate the development of vaccines and serological diagnostics for SARS-CoV-2.

The ongoing evolution of SARS-CoV-2 into more easily transmissible and infectious variants has sparked concern over the continued effectiveness of existing therapeutic antibodies and vaccines. Hence, together with increased genomic surveillance, methods to rapidly develop and assess effective interventions are critically needed. Here we report the discovery of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies isolated from COVID-19 patients using a high-throughput platform. Antibodies were identified from unpaired donor B-cell and serum repertoires using yeast surface display, proteomics, and public light chain screening. Cryo-EM and functional characterization of the antibodies identified N3-1, an antibody that binds avidly (Kd,app = 68 pM) to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein and robustly neutralizes the virus in vitro. This antibody likely binds all three RBDs of the trimeric spike protein with a single IgG. Importantly, N3-1 equivalently binds spike proteins from emerging SARS-CoV-2 variants of concern, neutralizes UK variant B.1.1.7, and binds SARS-CoV spike with nanomolar affinity. Taken together, the strategies described herein will prove broadly applicable in interrogating adaptive immunity and developing rapid response biological countermeasures to emerging pathogens.

Summary The worldwide spread of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has led to the repeated emergence of variants of concern. The Omicron variant has two dominant sub-lineages, BA.1 and BA.2, each with unprecedented numbers of nonsynonymous and indel spike protein mutations: 33 and 29, respectively. Some of these mutations individually increase transmissibility and enhance immune evasion, but their interactions within the Omicron mutational background is unknown. We characterize the molecular effects of all Omicron spike mutations on expression, human ACE2 receptor affinity, and neutralizing antibody recognition. We show that key mutations enable escape from neutralizing antibodies at a variety of epitopes. Stabilizing mutations in the N-terminal and S2 domains of the spike protein compensate for destabilizing mutations in the receptor binding domain, thereby enabling the record number of mutations in Omicron sub-lineages. Taken together, our results provide a comprehensive account of the mutational effects in the Omicron spike protein and illuminate previously unknown mechanisms of how the N-terminal domain can compensate for destabilizing mutations within the more evolutionarily constrained RBD.

Abstract The SARS-CoV-2 spike (S) protein is a critical component of subunit vaccines and a target for neutralizing antibodies. Spike is also undergoing immunogenic selection with clinical variants that increase infectivity and partially escape convalescent plasma. Here, we describe spike display, a high-throughput platform to rapidly characterize glycosylated spike ectodomains across multiple coronavirus-family proteins. We assayed ∼200 variant SARS-CoV-2 spikes for their expression, ACE2 binding, and recognition by thirteen neutralizing antibodies (nAbs). An alanine scan of all five N-terminal domain (NTD) loops highlights a public class of epitopes in the N1, N3, and N5 loops that are recognized by most of the NTD-binding nAbs. Some clinical NTD substitutions abrogate binding to these epitopes but are circulating at low frequencies around the globe. NTD mutations in variants of concern B.1.1.7 (United Kingdom), B.1.351 (South Africa), B.1.1.248 (Brazil), and B.1.427/B.1.429 (California) impact spike expression and escape most NTD-targeting nAbs. However, two classes of NTD nAbs still bind B.1.1.7 spikes and neutralize in pseudoviral assays. B.1.351 and B.1.1.248 include compensatory mutations that either increase spike expression or increase ACE2 binding affinity. Finally, B.1.351 and B.1.1.248 completely escape a potent ACE2 peptide mimic. We anticipate that spike display will accelerate antigen design, deep scanning mutagenesis, and antibody epitope mapping for SARS-CoV-2 and other emerging viral threats.

Abstract The repair of DNA double-strand breaks occurs through non-homologous end joining or homologous recombination in vertebrate cells - a choice that is thought to be decided by a competition between DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) and the Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) complex but is not well understood. Using ensemble biochemistry and single-molecule approaches, here we show that the MRN complex is dependent on DNA-PK and phosphorylated CtIP to perform efficient processing and resection of DNA ends in physiological conditions, thus eliminating the competition model. Endonucleolytic removal of DNA-PK-bound DNA ends is also observed at double-strand break sites in human cells. The involvement of DNA-PK in MRN-mediated end processing promotes an efficient and sequential transition from non-homologous end joining to homologous recombination by facilitating DNA-PK removal. One Sentence Summary DNA-dependent protein kinase, an enzyme critical for non-homologous repair of DNA double-strand breaks, also stimulates end processing for homologous recombination.

Abstract Dozens of new antiviral systems have been recently characterized in bacteria. Some of these systems are present in eukaryotes and appear to have originated in prokaryotes, but little is known about these defense mechanisms in archaea. Here, we explore the diversity and distribution of defense systems in archaea and identify 2610 complete systems in Asgardarchaeota , a group of archaea related to eukaryotes. The Asgard defense systems comprise 89 unique systems, including argonaute, NLR, Mokosh, viperin, Lassamu, and CBASS. Asgard viperin and argonaute proteins have structural homology to eukaryotic proteins, and phylogenetic analyses suggest that eukaryotic viperin proteins were derived from Asgard viperins. We show that Asgard viperins display anti-phage activity when heterologously expressed in bacteria. Eukaryotic and bacterial argonaute proteins appear to have originated in Asgardarchaeota , and Asgard argonaute proteins have argonaute-PIWI domains, key components of eukaryotic RNA interference systems. Our results support that Asgardarchaeota played important roles in the origin of antiviral defense systems in eukaryotes.

NanoCluster Beacons (NCBs) are multicolor silver nanocluster probes whose fluorescence can be activated or tuned by a proximal DNA strand called the activator. While a single-nucleotide difference in a pair of activators can lead to drastically different activation outcomes, termed the polar opposite twins (POTs), it is difficult to discover new POT-NCBs using the conventional low-throughput characterization approaches. Here we report a high-throughput selection method that takes advantage of repurposed next-generation-sequencing (NGS) chips to screen the activation fluorescence of ∼40,000 activator sequences. We find the nucleobases at positions 7-12 of the 18-nucleotide-long activator are critical to creating bright NCBs and positions 4-6 and 2-4 are hotspots to generate yellow and red POTs, respectively. Based on these findings, we propose a “zipper bag model” that explains how these hotspots lead to the creation of distinct silver cluster chromophores and contribute to the difference in chromophore chemical yields. Combining high-throughput screening with machine learning algorithms, we establish a pipeline to rationally design bright and multicolor NCBs.

Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) is one of the first responders to DNA damage and plays crucial roles in recruiting DNA repair proteins through its activity, poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation). The enrichment of DNA repair proteins at sites of DNA damage has been described as the formation of a biomolecular condensate. However, it is not understood how PARP1 and PARylation contribute to the formation and organization of DNA repair condensates. Using recombinant human PARP1 in vitro, we find that PARP1 readily forms viscous biomolecular condensates in a DNA-dependent manner and that this depends on its three zinc finger (ZnF) domains. PARylation enhances PARP1 condensation in a PAR chain-length dependent manner and increases the internal dynamics of PARP1 condensates. DNA and single-strand break repair proteins XRCC1, LigIII, PolB, and FUS partition in PARP1 condensates, although in different patterns. While PolB and FUS are both homogeneously mixed within PARP1 condensates, FUS enrichment is greatly enhanced upon PARylation whereas PolB partitioning is not. XRCC1 and LigIII display an inhomogeneous organization within PARP1 condensates; their enrichment in these multiphase condensates is enhanced by PARylation. Functionally, PARP1 condensates concentrate short DNA fragments and facilitate compaction of long DNA and bridge DNA ends. Furthermore, the presence of PARP1 condensates significantly promotes DNA ligation upon PARylation. These findings provide insight into how PARP1 condensation and PARylation regulate the assembly and biochemical activities in DNA repair foci, which may inform on how PARPs function in other PAR-driven condensates.

RNA-binding proteins (RBPs) play essential roles in biology and are frequently associated with human disease. While recent studies have systematically identified individual RBPs, their higher order assembly into Ribonucleoprotein (RNP) complexes has not been systematically investigated. Here, we describe a proteomics method for systematic identification of RNP complexes in human cells. We identify 1,428 protein complexes that associate with RNA, indicating that over 20% of known human protein complexes contain RNA. To explore the role of RNA in the assembly of each complex, we identify complexes that dissociate, change composition, or form stable protein-only complexes in the absence of RNA. Importantly, these data also provide specific novel insights into the function of well-studied protein complexes not previously known to associate with RNA, including replication factor C (RFC) and cytokinetic centralspindlin complex. Finally, we use our method to systematically identify cell-type specific RNA-associated proteins in mouse embryonic stem cells. We distribute these data as a resource, rna.MAP (rna.proteincomplexes.org) which provides a comprehensive dataset for the study of RNA-associated protein complexes. Our system thus provides a novel methodology for further explorations across human tissues and disease states, as well as throughout all domains of life.Summary An exploration of human protein complexes in the presence and absence of RNA reveals endogenous ribonucleoprotein complexes

Intrinsically disordered regions (IDRs) are present in at least 30% of the eukaryotic proteome and are enriched in chromatin-associated proteins. Using a combination of genetics, biochemistry, and single-molecule biophysics, we characterize how IDRs regulate the functions of the yeast MutLα (Mlh1-Pms1) mismatch repair (MMR) complex. Shortening or scrambling the IDRs in both subunits ablates MMR in vivo. Mlh1-Pms1 complexes with shorter IDRs that disrupt MMR retain wild-type DNA binding affinity but are impaired for diffusion on both naked and nucleosome-coated DNA. Moreover, the IDRs also regulate the ATP hydrolysis and nuclease activities that are encoded in the structured N- and C-terminal domains of the complex. This combination of phenotypes underlies the catastrophic MMR defect seen with the mutant MutLα in vivo. More broadly, this work highlights an unanticipated multi-functional role for IDRs in regulating both facilitated diffusion on chromatin and nucleolytic processing of a DNA substrate.