A differentiation protocol to obtain enteric nervous system (ENS) progenitors and a range of neurons from human pluripotent stem cells is developed; the cells can migrate and graft to the colon of a chick embryo and an adult mouse colon, including in a mouse model of Hirschsprung disease, in which a functional rescue is observed. The enteric nervous system (ENS) is essential to normal gut function and works to some extent independently from other neuronal circuits. Lorenz Studer and colleagues have developed a differentiation protocol for human pluripotent stem cells to obtain ENS progenitors and a range of neurons found in the ENS. They show that these can migrate and graft to the gut of a chick embryo and adult mouse colon, including in a mouse model of Hirschsprung disease, in which they observe a functional rescue. The authors also show that ENS precursors derived from patients affected by Hirschsprung disease can be used to screen for drugs that can modulate the properties of these cells. The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the autonomic nervous system, with neuron numbers surpassing those present in the spinal cord1. The ENS has been called the ‘second brain’1 given its autonomy, remarkable neurotransmitter diversity and complex cytoarchitecture. Defects in ENS development are responsible for many human disorders including Hirschsprung disease (HSCR). HSCR is caused by the developmental failure of ENS progenitors to migrate into the gastrointestinal tract, particularly the distal colon2. Human ENS development remains poorly understood owing to the lack of an easily accessible model system. Here we demonstrate the efficient derivation and isolation of ENS progenitors from human pluripotent stem (PS) cells, and their further differentiation into functional enteric neurons. ENS precursors derived in vitro are capable of targeted migration in the developing chick embryo and extensive colonization of the adult mouse colon. The in vivo engraftment and migration of human PS-cell-derived ENS precursors rescue disease-related mortality in HSCR mice (Ednrbs-l/s-l), although the mechanism of action remains unclear. Finally, EDNRB-null mutant ENS precursors enable modelling of HSCR-related migration defects, and the identification of pepstatin A as a candidate therapeutic target. Our study establishes the first, to our knowledge, human PS-cell-based platform for the study of human ENS development, and presents cell- and drug-based strategies for the treatment of HSCR.

Mounting evidence indicates that the nervous system plays a central role in cancer pathogenesis. In turn, cancers and cancer therapies can alter nervous system form and function. This Commentary seeks to describe the burgeoning field of “cancer neuroscience” and encourage multidisciplinary collaboration for the study of cancer-nervous system interactions. Mounting evidence indicates that the nervous system plays a central role in cancer pathogenesis. In turn, cancers and cancer therapies can alter nervous system form and function. This Commentary seeks to describe the burgeoning field of “cancer neuroscience” and encourage multidisciplinary collaboration for the study of cancer-nervous system interactions. A growing appreciation that nervous system activity regulates development, homeostasis, plasticity, and regeneration in diverse tissues has prompted investigations of similar roles for dictating cancer formation and progression. Numerous examples have now come to light that reveal mechanistic parallels in the way the nervous system regulates normal and neoplastic cellular function across a range of tissue types. As such, nervous system-cancer crosstalk—both systemically and within the local tumor microenvironment—is now emerging as a crucial regulator of cancer initiation and progression. However, much remains to be learned. The finding that neurons constitute an important non-neoplastic cell type in a broad range of cancers galvanized a recent Banbury meeting on the Nervous System and Cancer (December 10–13, 2019), engaging members of the neuroscience and cancer biology communities. We have written this Commentary in an effort to elucidate emerging principles, identify pressing unanswered questions, and define the scope of this burgeoning new field of “cancer neuroscience.” The nervous system branches as extensively as the circulatory system, and this dense innervation of nearly all tissues—from bone marrow (Katayama et al., 2006Katayama Y. Battista M. Kao W.M. Hidalgo A. Peired A.J. Thomas S.A. Frenette P.S. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.Cell. 2006; 124: 407-421Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1021) Google Scholar) to salivary glands (Knox et al., 2010Knox S.M. Lombaert I.M. Reed X. Vitale-Cross L. Gutkind J.S. Hoffman M.P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.Science. 2010; 329: 1645-1647Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar)—is essential to regulate normal tissue function. Analogous to its role in organogenesis, tissue homeostasis, plasticity, and regeneration, the nervous system can also control malignant tumor initiation, growth, and metastasis. While the molecular mechanisms by which neural cells influence cancer cells vary by tissue type, one unifying principle is that the functional effect of the neural-cancer interaction can typically be predicted by the influence of nervous system elements on the normal cellular counterpart of a given cancer. This principle is illustrated by the parallel influences of neuronal activity on normal and neoplastic glial cell proliferation. In the central nervous system (CNS), where glutamatergic neuronal activity promotes glial precursor cell proliferation (Gibson et al., 2014Gibson E.M. Purger D. Mount C.W. Goldstein A.K. Lin G.L. Wood L.S. Inema I. Miller S.E. Bieri G. Zuchero J.B. et al.Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.Science. 2014; 344: 1252304Crossref PubMed Scopus (806) Google Scholar), the activity of glutamatergic neurons similarly drives the growth of malignant gliomas in experimental model systems (Venkatesh et al., 2015Venkatesh H.S. Johung T.B. Caretti V. Noll A. Tang Y. Nagaraja S. Gibson E.M. Mount C.W. Polepalli J. Mitra S.S. et al.Neuronal Activity Promotes Glioma Growth through Neuroligin-3 Secretion.Cell. 2015; 161: 803-816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar, Venkatesh et al., 2019Venkatesh H.S. Morishita W. Geraghty A.C. Silverbush D. Gillespie S.M. Arzt M. Tam L.T. Espenel C. Ponnuswami A. Ni L. et al.Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.Nature. 2019; 573: 539-545Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar). The underlying mechanisms involve both paracrine signaling and direct electrochemical communication (Figures 1A and 1B ). Neuronal-activity-dependent secretion of growth factors from neurons and from activity-sensing glial cells promotes glioma progression (Venkatesh et al., 2015Venkatesh H.S. Johung T.B. Caretti V. Noll A. Tang Y. Nagaraja S. Gibson E.M. Mount C.W. Polepalli J. Mitra S.S. et al.Neuronal Activity Promotes Glioma Growth through Neuroligin-3 Secretion.Cell. 2015; 161: 803-816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar). In addition, malignant cells can electrically integrate into neural circuitry through bona fide neuron-to-glioma synapses (Venkataramani et al., 2019Venkataramani V. Tanev D.I. Strahle C. Studier-Fischer A. Fankhauser L. Kessler T. Körber C. Kardorff M. Ratliff M. Xie R. et al.Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.Nature. 2019; 573: 532-538Crossref PubMed Scopus (340) Google Scholar, Venkatesh et al., 2019Venkatesh H.S. Morishita W. Geraghty A.C. Silverbush D. Gillespie S.M. Arzt M. Tam L.T. Espenel C. Ponnuswami A. Ni L. et al.Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.Nature. 2019; 573: 539-545Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar). Malignant glioma cells are themselves coupled by gap junctions, such that neuronal activity-dependent currents propagate through an extensively interconnected neural-glioma network (Venkataramani et al., 2019Venkataramani V. Tanev D.I. Strahle C. Studier-Fischer A. Fankhauser L. Kessler T. Körber C. Kardorff M. Ratliff M. Xie R. et al.Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.Nature. 2019; 573: 532-538Crossref PubMed Scopus (340) Google Scholar, Venkatesh et al., 2019Venkatesh H.S. Morishita W. Geraghty A.C. Silverbush D. Gillespie S.M. Arzt M. Tam L.T. Espenel C. Ponnuswami A. Ni L. et al.Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.Nature. 2019; 573: 539-545Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar). Post-synaptic electrical signaling promotes cancer progression through glioma cell membrane potential depolarization (Venkatesh et al., 2019Venkatesh H.S. Morishita W. Geraghty A.C. Silverbush D. Gillespie S.M. Arzt M. Tam L.T. Espenel C. Ponnuswami A. Ni L. et al.Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.Nature. 2019; 573: 539-545Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar) and consequent voltage-sensitive mechanisms that remain to be elucidated. The cancer-promoting effect of excitatory neurotransmission extends to brain metastases as well. Breast cancer cells that have metastasized to the brain upregulate neurotransmitter receptor expression and extend perisynaptic processes to receive neuronal-activity-dependent neurotransmitter signals that trigger a receptor-mediated signaling cascade, induce inward currents in the malignant cells, and drive growth of breast cancer brain metastases (Zeng et al., 2019Zeng Q. Michael I.P. Zhang P. Saghafinia S. Knott G. Jiao W. McCabe B.D. Galván J.A. Robinson H.P.C. Zlobec I. et al.Synaptic proximity enables NMDAR signalling to promote brain metastasis.Nature. 2019; 573: 526-531Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). How other types of metastatic cancer may interact with CNS neurons remains to be determined. Outside of the CNS, peripheral-nerve-derived neurotransmitter and growth factor signaling similarly regulate the progression of diverse cancers, including pancreatic, gastric, colon, prostate, breast, oral, and skin cancers in experimental model systems (Figure 1B) (Magnon et al., 2013Magnon C. Hall S.J. Lin J. Xue X. Gerber L. Freedland S.J. Frenette P.S. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.Science. 2013; 341: 1236361Crossref PubMed Scopus (658) Google Scholar, Hayakawa et al., 2017Hayakawa Y. Sakitani K. Konishi M. Asfaha S. Niikura R. Tomita H. Renz B.W. Tailor Y. Macchini M. Middelhoff M. et al.Nerve Growth Factor Promotes Gastric Tumorigenesis through Aberrant Cholinergic Signaling.Cancer Cell. 2017; 31: 21-34Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar, Renz et al., 2018Renz B.W. Tanaka T. Sunagawa M. Takahashi R. Jiang Z. Macchini M. Dantes Z. Valenti G. White R.A. Middelhoff M.A. et al.Cholinergic Signaling via Muscarinic Receptors Directly and Indirectly Suppresses Pancreatic Tumorigenesis and Cancer Stemness.Cancer Discov. 2018; 8: 1458-1473Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). Signaling between sympathetic, parasympathetic, or sensory nerves in the tumor microenvironment and malignant cells may regulate cancer initiation, progression, or metastasis, often through neurotransmitter-dependent signaling cascades. The function of a given nerve type must be understood in a context-specific manner. For example, parasympathetic (i.e., cholinergic) nerves may exert opposite effects in different tumor tissue types, such as promoting growth in the cancer of one organ and inhibiting growth in the cancer of another. In this regard, cholinergic signaling inhibits the growth and progression of pancreatic adenocarcinoma (Renz et al., 2018Renz B.W. Tanaka T. Sunagawa M. Takahashi R. Jiang Z. Macchini M. Dantes Z. Valenti G. White R.A. Middelhoff M.A. et al.Cholinergic Signaling via Muscarinic Receptors Directly and Indirectly Suppresses Pancreatic Tumorigenesis and Cancer Stemness.Cancer Discov. 2018; 8: 1458-1473Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar) but strongly promotes adenocarcinoma of the stomach (Hayakawa et al., 2017Hayakawa Y. Sakitani K. Konishi M. Asfaha S. Niikura R. Tomita H. Renz B.W. Tailor Y. Macchini M. Middelhoff M. et al.Nerve Growth Factor Promotes Gastric Tumorigenesis through Aberrant Cholinergic Signaling.Cancer Cell. 2017; 31: 21-34Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar), an organ in which parasympathetic innervation is dominant. It is not yet known whether peripheral nerve-cancer cell interactions exclusively reflect paracrine-signaling events or whether nerve-to-cancer cell synapses, synapse-like structures, or electrical coupling exist outside of the CNS that enable peripheral nerve to cancer communication. Moreover, the roles of diverse peripheral glial cells in nerve-cancer interactions outside of the CNS are largely unexplored. Nervous system-cancer crosstalk occurs both through direct nerve-cancer interactions and via nervous system regulation of other cell types within the tumor microenvironment (e.g., immune cells, endothelial cells). These neural-cancer interactions may occur between neurons or nerves in the local microenvironment (Figure 1B) or through systemic signaling (Figure 1C), such as through elevated circulating catecholamines (neurotransmitters). Neural regulation of angiogenesis via endothelial cell metabolism (Zahalka et al., 2017Zahalka A.H. Arnal-Estapé A. Maryanovich M. Nakahara F. Cruz C.D. Finley L.W.S. Frenette P.S. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer.Science. 2017; 358: 321-326Crossref PubMed Scopus (227) Google Scholar) or immune system function (Borovikova et al., 2000Borovikova L.V. Ivanova S. Zhang M. Yang H. Botchkina G.I. Watkins L.R. Wang H. Abumrad N. Eaton J.W. Tracey K.J. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.Nature. 2000; 405: 458-462Crossref PubMed Scopus (2941) Google Scholar) represent distinct mechanisms through which the nervous system may exert a systemic effect on the tumor environment, and interdisciplinary efforts involving oncology, immunology, and neuroscience are needed to fully dissect these important neural-immune-cancer interactions. Nervous system-cancer crosstalk is bidirectional, and cancers may induce profound nervous system remodeling and dysfunction. Secreted signals from brain tumors (gliomas) influence the function of invaded neural circuits by inducing aberrant synaptogenesis, increasing neuronal excitability, and causing seizures (Yu et al., 2020Yu K. Lin C.J. Hatcher A. Lozzi B. Kong K. Huang-Hobbs E. Cheng Y.T. Beechar V.B. Zhu W. Zhang Y. et al.PIK3CA variants selectively initiate brain hyperactivity during gliomagenesis.Nature. 2020; 578: 166-171Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar). This pathological increase in neuronal activity promotes the activity-dependent signals that drive glioma growth (Venkatesh et al., 2015Venkatesh H.S. Johung T.B. Caretti V. Noll A. Tang Y. Nagaraja S. Gibson E.M. Mount C.W. Polepalli J. Mitra S.S. et al.Neuronal Activity Promotes Glioma Growth through Neuroligin-3 Secretion.Cell. 2015; 161: 803-816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar, Venkatesh et al., 2019Venkatesh H.S. Morishita W. Geraghty A.C. Silverbush D. Gillespie S.M. Arzt M. Tam L.T. Espenel C. Ponnuswami A. Ni L. et al.Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.Nature. 2019; 573: 539-545Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar, Venkataramani et al., 2019Venkataramani V. Tanev D.I. Strahle C. Studier-Fischer A. Fankhauser L. Kessler T. Körber C. Kardorff M. Ratliff M. Xie R. et al.Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.Nature. 2019; 573: 532-538Crossref PubMed Scopus (340) Google Scholar). Similarly, cancers outside of the CNS can act at a distance to disrupt normal brain function (e.g., sleep) (Figure 1C) (Borniger et al., 2018Borniger J.C. Walker Ii W.H. Surbhi Emmer K.M. Zhang N. Zalenski A.A. Muscarella S.L. Fitzgerald J.A. Smith A.N. Braam C.J. et al.A Role for Hypocretin/Orexin in Metabolic and Sleep Abnormalities in a Mouse Model of Non-metastatic Breast Cancer.Cell Metab. 2018; 28: 118-129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar). In the peripheral nervous system (PNS), cancers induce axonal ingrowth (axonogenesis) into the tumor microenvironment (Figure 1B) (Hayakawa et al., 2017Hayakawa Y. Sakitani K. Konishi M. Asfaha S. Niikura R. Tomita H. Renz B.W. Tailor Y. Macchini M. Middelhoff M. et al.Nerve Growth Factor Promotes Gastric Tumorigenesis through Aberrant Cholinergic Signaling.Cancer Cell. 2017; 31: 21-34Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar), where nerve density strongly correlates with cancer aggressiveness in many tumor types. Axonogenesis has been shown in several tumor types to be promoted by cancer cell secretion of neurotrophins (such as nerve growth factor), often through a feed-forward mechanism triggered by increased adrenergic or cholinergic signaling (Hayakawa et al., 2017Hayakawa Y. Sakitani K. Konishi M. Asfaha S. Niikura R. Tomita H. Renz B.W. Tailor Y. Macchini M. Middelhoff M. et al.Nerve Growth Factor Promotes Gastric Tumorigenesis through Aberrant Cholinergic Signaling.Cancer Cell. 2017; 31: 21-34Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar). Beyond axonogenesis, recent studies have described neurogenesis within the tumor microenvironment from neural precursor cells detected only in the circulation of subjects with cancer (Mauffrey et al., 2019Mauffrey P. Tchitchek N. Barroca V. Bemelmans A.P. Firlej V. Allory Y. Roméo P.H. Magnon C. Progenitors from the central nervous system drive neurogenesis in cancer.Nature. 2019; 569: 672-678Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar). Cancers also exhibit a propensity to invade nerve fibers (“perineural invasion”), causing remodeling of these peripheral nerves and chronic pain syndromes. In both central and peripheral cancers, this structural and functional remodeling of the nervous system amplifies neuron-cancer interactions and contributes to cancer growth and to cancer-related symptoms. Elucidating the mechanisms by which cancer therapy alters nervous system function (Figure 1D) is central to understanding the bidirectional interactions between neural and malignant cells. Traditional cancer therapies, such as radiation and chemotherapies, exert long-lasting deleterious effects on nervous system function, evident as cancer-therapy-related cognitive impairment (colloquially known as “chemobrain” or “chemofog,” a syndrome characterized by impaired attention, memory, multi-tasking, and sometimes increased anxiety) and as peripheral neuropathies (sensory loss, motor weakness, or pain). Similar long-term nervous system effects of newer targeted therapies and cancer immunotherapies are incompletely understood and only now beginning to come to light. Cancer therapies differentially affect cognition, as well as the types of nerves predominantly affected in chemotherapy-associated peripheral neuropathy. The underlying cellular and molecular etiologies of cancer-therapy-induced neural toxicity are becoming better understood, and therapeutic strategies aimed at neuroprotection or neural regeneration are now beginning to emerge (Gibson et al., 2019Gibson E.M. Nagaraja S. Ocampo A. Tam L.T. Wood L.S. Pallegar P.N. Greene J.J. Geraghty A.C. Goldstein A.K. Ni L. et al.Methotrexate Chemotherapy Induces Persistent Tri-glial Dysregulation that Underlies Chemotherapy-Related Cognitive Impairment.Cell. 2019; 176: 43-55Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (160) Google Scholar, Pease-Raissi et al., 2017Pease-Raissi S.E. Pazyra-Murphy M.F. Li Y. Wachter F. Fukuda Y. Fenstermacher S.J. Barclay L.A. Bird G.H. Walensky L.D. Segal R.A. Paclitaxel Reduces Axonal Bclw to Initiate IP3R1-Dependent Axon Degeneration.Neuron. 2017; 96: 373-386Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (61) Google Scholar). However, to what extent chemotherapy-induced neuropathy modulates nerve-cancer interactions to limit malignant growth is not yet clear, and the potentially beneficial role that therapy-induced neurotoxicity may play in the anti-neoplastic efficacy of radiation and chemotherapy remains to be explored. A more complete elucidation of both the mechanisms and implications of cancer-therapy-induced neurotoxicity are needed in order to develop optimized therapeutic strategies aimed at both effectively treating cancer and minimizing the debilitating neurological side effects. Much remains to be discovered with respect to the fundamental biology of the PNS and its role in normal tissue development, homeostasis, plasticity, and regeneration. The resulting knowledge from developmental and regenerative biology will be synergistic to understanding these interactions in cancer. Analogous to circuit-mapping efforts of the CNS over the past decade, similar mapping of the cranial, peripheral, and enteric nervous systems is warranted, as their complex anatomy remains poorly characterized. Moreover, single-cell analyses, coupled with the development of new tools for lineage analysis and pluripotent stem cell modeling, will be required to define and associate the myriad nerve types with specific cancer phenotypes. We are only beginning to uncover how the nervous system contributes to the initiation, growth, spread, recurrence, and therapeutic resistance of cancers. The powerful tools of modern neuroscience, from electrophysiology to optogenetics, should be leveraged toward an understanding of cancer pathophysiology. Tissue- and tumor-type-specific differences underscore the need for careful investigation of each type of cancer over the course of its progression to elucidate the ways in which malignancy and cancer-induced nervous system remodeling co-evolve. A more complete understanding will require true interdisciplinary study and collaboration between the disciplines of neuroscience, developmental biology, immunology, and cancer biology. Attention should be given not only to direct neuron-cancer cell interactions, but also to the influence of the nervous system on other cells of the local stromal, immune, and systemic tumor environment. At this intersection of fields, exciting opportunities exist for cancer biologists to complement the great strides made in cancer genomics, immuno-oncology, and precision therapeutics with a new dimension in the armamentarium and for neuroscientists to take full advantage of sophisticated modern neuroscience approaches for the benefit of millions of individuals suffering from cancer and the effects of its current therapies. While much remains to be learned about neural regulation of tumor growth, early-phase clinical trials are already underway, targeting neural mechanisms that modulate tumor growth in specific tumor types. Precise targeting of neural-cancer interactions will ultimately provide new opportunities for improving outcomes of many difficult-to-treat malignancies. The authors would like to thank the National Cancer Institute (NCI) and Dr. Chamelli Jhappan for early appreciation of nervous system-cancer interactions and organization of the foundational “Nerves in Cancer” meeting in 2015. We appreciate the insightful input from Barbara Marte, Chamelli Jhappan, Pearl Huang, Grazia Piizzi, Shan Lou, Daniel Blom, and Alexandra Lantermann throughout the meeting. We also thank Rebecca Leshan at Banbury Center and Pearl Huang at Cygnal Therapeutics for their support in organizing the 2019 Banbury meeting. M.M., P.S.F., T.C.W, H.H., E.K.S. and D.A.T. are on the SAB for Cygnal Therapeutics. J.B.H. is an employee of Cygnal Therapeutics. F.W. is co-founder of Divide & Conquer (DC Europa Ltd).

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection has led to a global health crisis, and yet our understanding of the disease pathophysiology and potential treatment options remains limited. SARS-CoV-2 infection occurs through binding and internalization of the viral spike protein to angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) on the host cell membrane. Lethal complications are caused by damage and failure of vital organs that express high levels of ACE2, including the lungs, the heart and the kidneys. Here, we established a high-throughput drug screening strategy to identify therapeutic candidates that reduce ACE2 levels in human embryonic stem cell (hESC) derived cardiac cells. Drug target analysis of validated hit compounds, including 5 alpha reductase inhibitors, revealed androgen signaling as a key modulator of ACE2 levels. Treatment with the 5 alpha reductase inhibitor dutasteride reduced ACE2 levels and internalization of recombinant spike receptor binding domain (Spike-RBD) in hESC-derived cardiac cells and human alveolar epithelial cells. Finally, clinical data on coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients demonstrated that abnormal androgen states are significantly associated with severe disease complications and cardiac injury as measured by blood troponin T levels. These findings provide important insights on the mechanism of increased disease susceptibility in male COVID-19 patients and identify androgen receptor inhibition as a potential therapeutic strategy.

Abstract The enteric nervous system (ENS) plays a central role in gut physiology and mediating the crosstalk between the gastrointestinal (GI) tract and other organs. The human ENS has remained elusive, highlighting the need for an in vitro modeling and mapping blueprint. Here we map out the developmental and functional features of the human ENS, by establishing robust and scalable 2D ENS cultures and 3D enteric ganglioids from human pluripotent stem cells (hPSCs). These models recapitulate the remarkable neuronal and glial diversity found in primary tissue and enable comprehensive molecular analyses that uncover functional and developmental relationships within these lineages. As a salient example of the power of this system, we performed in-depth characterization of enteric nitrergic neurons (NO neurons) which are implicated in a wide range of GI motility disorders. We conducted an unbiased screen and identified drug candidates that modulate the activity of NO neurons and demonstrated their potential in promoting motility in mouse colonic tissue ex vivo . We established a high-throughput strategy to define the developmental programs involved in NO neuron specification and discovered that PDGFR inhibition boosts the induction of NO neurons in enteric ganglioids. Transplantation of these ganglioids in the colon of NO neuron-deficient mice results in extensive tissue engraftment, providing a xenograft model for the study of human ENS in vivo and the development of cell-based therapies for neurodegenerative GI disorders. These studies provide a framework for deciphering fundamental features of the human ENS and designing effective strategies to treat enteric neuropathies.

SUMMARY Schwann cells (SCs) are the myelinating and non-myelinating glia of the peripheral nervous system (PNS) and are essential for its function. Defects in SCs are associated with many PNS disorders including diabetic peripheral neuropathy (DPN), a condition affecting millions of patients. Here we present a strategy for deriving and purifying SCs from human pluripotent stem cells (hPSCs). The scalable cultures of SCs allow basic and translational applications such as high-resolution molecular and functional characterization, developmental studies, modeling and mechanistic understanding of SC diseases and drug discovery. Our hPSC-derived SCs recapitulate the key molecular features of primary SCs and are capable of engrafting efficiently and producing myelin in injured sciatic nerves in rats. We further established an hPSC-based in vitro model of DPN that revealed the selective vulnerability of human SCs to hyperglycemia-induced cytotoxicity. We established a high-throughput screening system that identified a candidate drug that counteracts glucose-mediated cytotoxicity in SCs and normalizes glucose-induced transcriptional and metabolic abnormalities in SCs. Treatment of hyperglycemic mice with this drug candidate rescues sensory function, prevents SC death, and counteracts myelin damage in sciatic nerves suggesting considerable potential as a novel treatment for DPN.

Abstract GI toxicity is a common dose-limiting adverse effect of platin chemotherapy treatment. Up to 50% of cancer survivors continue to experience symptoms of chronic constipation or diarrhea induced by their chemotherapy for many years after their treatment. This drug toxicity is largely attributed to damage to enteric neurons that innervate the GI tract and control GI motility. The mechanisms responsible for platin-induced enteric neurotoxicity and potential preventative strategies have remained unknown. Here, we use human pluripotent stem cell derived enteric neurons to establish a new model system capable of uncovering the mechanism of platin-induced enteric neuropathy. Utilizing this scalable system, we performed a high throughput screen and identified drug candidates and pathways involved in the disease. Our analyses revealed that excitotoxicity through muscarinic cholinergic signaling is a key driver of platin-induced enteric neuropathy. Using single nuclei transcriptomics and functional assays, we discovered that this disease mechanism leads to increased susceptibility of specific neuronal subtypes, including inhibitory nitrergic neurons, to platins. Histological assessment of the enteric nervous system in platin-treated patients confirmed the selective loss of nitrergic neurons. Finally, we demonstrated that pharmacological and genetic inhibition of muscarinic cholinergic signaling is sufficient to rescue enteric neurons from platin excitotoxicity in vitro and can prevent platin-induced constipation and degeneration of nitrergic neurons in mice. These studies define the mechanisms of platin-induced enteric neuropathy and serve as a framework for uncovering cell type-specific manifestations of cellular stress underlying numerous intractable peripheral neuropathies.

Summary/Abstract The neural crest (NC) is highly multipotent and generates diverse lineages in the developing embryo. However, spatiotemporally distinct NC populations display differences in fate potential, such as increased gliogenic and parasympathetic potential from later migrating, nerve-associated Schwann cell precursors (SCPs). Interestingly, while melanogenic potential is shared by both early migrating NC and SCPs, differences in melanocyte identity resulting from differentiation through these temporally distinct progenitors have not been determined. Here, we leverage a human pluripotent stem cell (hPSC) model of NC temporal patterning to comprehensively characterize human NC heterogeneity, fate bias, and lineage development. We captured the transition of NC differentiation between temporally and transcriptionally distinct melanogenic progenitors and identified modules of candidate transcription factor and signaling activity associated with this transition. For the first time, we established a protocol for the directed differentiation of melanocytes from hPSCs through a SCP intermediate, termed trajectory 2 (T2) melanocytes. Leveraging an existing protocol for differentiating early NC-derived melanocytes, termed trajectory 1 (T1), we performed the first comprehensive comparison of transcriptional and functional differences between these distinct melanocyte populations, revealing differences in pigmentation and unique expression of transcription factors, ligands, receptors and surface markers. We found a significant link between the T2 melanocyte transcriptional signature and decreased survival in melanoma patients in the cancer genome atlas (TCGA). We performed an in vivo CRISPRi screen of T1 and T2 melanocyte signature genes in a human melanoma cell line and discovered several T2-specific markers that promote lung metastasis in mice. We further demonstrated that one of these factors, SNRPB, regulates the splicing of transcripts involved in metastasis relevant functions such as migration, cell adhesion and proliferation. Overall, this study identifies distinct developmental trajectories as a source of diversity in melanocytes and implicates the unique molecular signature of SCP-derived melanocytes in metastatic melanoma.

Summary The enteric nervous system (ENS) is a tantalizing frontier in neuroscience. With the recent emergence of single cell transcriptomic technologies, this rare and poorly understood tissue has begun to be better characterized in recent years. A precise functional mapping of enteric neuron diversity is critical for understanding ENS biology and enteric neuropathies. Nonetheless, this pursuit has faced considerable technical challenges. By leveraging different methods to compare available primary mouse and human ENS datasets, we underscore the urgent need for careful identity annotation, achieved through the harmonization and advancements of wet lab and computational techniques. We took different approaches including differential gene expression, module scoring, co-expression and correlation analysis, unbiased biological function hierarchical clustering, data integration and label transfer to compare and contrast functional annotations of several independently reported ENS datasets. These analyses highlight substantial discrepancies stemming from an overreliance on transcriptomics data without adequate validation in tissues. To achieve a comprehensive understanding of enteric neuron identity and their functional context, it is imperative to expand tissue sources and incorporate innovative technologies such as multiplexed imaging, electrophysiology, spatial transcriptomics, as well as comprehensive profiling of epigenome, proteome, and metabolome. Harnessing human pluripotent stem cell (hPSC) models provides unique opportunities for delineating lineage trees of the human ENS, and offers unparalleled advantages, including their scalability and compatibility with genetic manipulation and unbiased screens. We encourage a paradigm shift in our comprehension of cellular complexity and function in the ENS by calling for large-scale collaborative efforts and research investments.

Abstract Chemotherapy-induced peripheral neuropathy (CIPN) is a dose-limiting adverse event associated with treatment with paclitaxel and other chemotherapeutic agents. The prevention and treatment of CIPN are limited by a lack of understanding of the molecular mechanisms underlying this toxicity. In the current study, a human induced pluripotent stem cell–derived sensory neuron (iPSC-SN) model was developed for the study of chemotherapy-induced neurotoxicity. The iPSC-SNs express proteins characteristic of nociceptor, mechanoreceptor and proprioceptor sensory neurons and show Ca 2+ influx in response to capsaicin, α,β-meATP and glutamate. iPSC-SNs are relatively resistant to the cytotoxic effects of paclitaxel, with IC 50 values of 38.1 μM (95% CI: 22.9 – 70.9 μM) for 48 hr exposure and 9.3 μM (95% CI: 5.7 – 16.5 μM) for 72 hr treatment. Paclitaxel causes dose- and time-dependent changes in neurite network complexity detected by βIII-tubulin staining and high content imaging. The IC 50 for paclitaxel reduction of neurite area was 1.4 μ M (95% CI: 0.3 - 16.9 μ M) for 48 hr exposure and 0.6 μ M (95% CI: 0.09 - 9.9 μ M) for 72 hr exposure. Decreased mitochondrial membrane potential, slower movement of mitochondria down the neurites and changes in glutamate-induced neuronal excitability were also observed with paclitaxel exposure. The iPSC-SNs were also sensitive to docetaxel, vincristine and bortezomib. Collectively, these data support the use of iPSC-SNs for detailed mechanistic investigations of genes and pathways implicated in chemotherapy-induced neurotoxicity and the identification of novel therapeutic approaches for its prevention and treatment.