Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is the latest respiratory pandemic resulting from zoonotic transmission of severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Severe symptoms include viral pneumonia secondary to infection and inflammation of the lower respiratory tract, in some cases causing death. We developed primary human lung epithelial infection models to understand responses of proximal and distal lung epithelium to SARS-CoV-2 infection. Differentiated air-liquid interface cultures of proximal airway epithelium and 3D organoid cultures of alveolar epithelium were readily infected by SARS-CoV-2 leading to an epithelial cell-autonomous proinflammatory response. We validated the efficacy of selected candidate COVID-19 drugs confirming that Remdesivir strongly suppressed viral infection/replication. We provide a relevant platform for studying COVID-19 pathobiology and for rapid drug screening against SARS-CoV-2 and future emergent respiratory pathogens.A novel infection model of the adult human lung epithelium serves as a platform for COVID-19 studies and drug discovery.

ABSTRACT Emergence of a highly contagious novel coronavirus, SARS-CoV-2 that causes COVID-19, has precipitated the current global health crisis with over 479,000 deaths and more than 9.3 million confirmed cases. Currently, our knowledge of the mechanisms of COVID-19 disease pathogenesis is very limited which has hampered attempts to develop targeted antiviral strategies. Therefore, we urgently need an effective therapy for this unmet medical need. Viruses hijack and dysregulate cellular machineries in order for them to replicate and infect more cells. Thus, identifying and targeting dysregulated signaling pathways that have been taken over by viruses is one strategy for developing an effective antiviral therapy. We have developed a high-throughput drug screening system to identify potential antiviral drugs targeting SARS-CoV-2. We utilized a small molecule library of 430 protein kinase inhibitors, which are in various stages of clinical trials. Most of the tested kinase antagonists are ATP competitive inhibitors, a class of nucleoside analogs, which have been shown to have potent antiviral activity. From the primary screen, we have identified 34 compounds capable of inhibiting viral cytopathic effect in epithelial cells. Network of drug and protein relations showed that these compounds specifically targeted a limited number of cellular kinases. More importantly, we have identified mTOR-PI3K-AKT, ABL-BCR/MAPK, and DNA-Damage Response (DDR) pathways as key cellular signaling pathways critical for SARS-CoV-2 infection. Subsequently, a secondary screen confirmed compounds such as Berzosertib (VE-822), Vistusertib (AZD2014), and Nilotinib with anti SARS-CoV-2 activity. Finally, we found that Berzosertib, an ATR kinase inhibitor in the DDR pathway, demonstrated potent antiviral activity in a human epithelial cell line and human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-derived cardiomyocytes. These inhibitors are already in clinical trials of phase 2 or 3 for cancer treatment, and can be repurposed as promising drug candidates for a host-directed therapy of SARS-CoV-2 infection. In conclusion, we have identified small molecule inhibitors exhibiting anti SARS-CoV-2 activity by blocking key cellular kinases, which gives insight on important mechanism of host-pathogen interaction. These compounds can be further evaluated for the treatment of COVID-19 patients following additional in vivo safety and efficacy studies. Disclosures None declared.

Antisense oligonucleotides (ASOs) are an emerging class of drugs that target RNAs. Current ASO designs strictly follow the rule of Watson-Crick base pairing along target sequences. However, RNAs often fold into structures that interfere with ASO hybridization. Here we developed a structure-based ASO design method and applied it to target severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Our method makes sure that ASO binding is compatible with target structures in three-dimensional (3D) space by employing structural design templates. These 3D-ASOs recognize the shapes and hydrogen bonding patterns of targets via tertiary interactions, achieving enhanced affinity and specificity. We designed 3D-ASOs that bind to the frameshift stimulation element and transcription regulatory sequence of SARS-CoV-2 and identified lead ASOs that strongly inhibit viral replication in human cells. We further optimized the lead sequences and characterized structure-activity relationship. The 3D-ASO technology helps fight coronavirus disease-2019 and is broadly applicable to ASO drug development.

Summary To date, there is no effective oral antiviral against SARS-CoV-2 that is also anti-inflammatory. Herein, we show that the mitochondrial antioxidant mitoquinone/mitoquinol mesylate (Mito-MES), a dietary supplement, has potent antiviral activity against SARS-CoV-2 and its variants of concern in vitro and in vivo . Mito-MES had nanomolar in vitro antiviral potency against the Beta and Delta SARS-CoV-2 variants as well as the murine hepatitis virus (MHV-A59). Mito-MES given in SARS-CoV-2 infected K18-hACE2 mice through oral gavage reduced viral titer by nearly 4 log units relative to the vehicle group. We found in vitro that the antiviral effect of Mito-MES is attributable to its hydrophobic dTPP+ moiety and its combined effects scavenging reactive oxygen species (ROS), activating Nrf2 and increasing the host defense proteins TOM70 and MX1. Mito-MES was efficacious reducing increase in cleaved caspase-3 and inflammation induced by SARS-CoV2 infection both in lung epithelial cells and a transgenic mouse model of COVID-19. Mito-MES reduced production of IL-6 by SARS-CoV-2 infected epithelial cells through its antioxidant properties (Nrf2 agonist, coenzyme Q10 moiety) and the dTPP moiety. Given established safety of Mito-MES in humans, our results suggest that Mito-MES may represent a rapidly applicable therapeutic strategy that can be added in the therapeutic arsenal against COVID-19. Its potential long-term use by humans as diet supplement could help control the SARS-CoV-2 pandemic, especially in the setting of rapidly emerging SARS-CoV-2 variants that may compromise vaccine efficacy. One-Sentence Summary Mitoquinone/mitoquinol mesylate has potent antiviral and anti-inflammatory activity in preclinical models of SARS-CoV-2 infection.

Abstract ORAI1 and STIM1 are the critical mediators of store-operated Ca 2+ entry by acting as the pore subunit and an endoplasmic reticulum-resident signaling molecule, respectively. In addition to Ca 2+ signaling, STIM1 is also involved in regulation of a cytosolic nucleic acid sensing pathway. Using ORAI1 and STIM1 knockout cells, we examined their contribution to the host response to SARS-CoV-2 infection. STIM1 knockout cells showed strong resistance to SARS-CoV-2 infection due to enhanced type I interferon response. On the contrary, ORAI1 knockout cells showed high susceptibility to SARS-CoV-2 infection as judged by increased expression of viral proteins and a high viral load. Mechanistically, ORAI1 knockout cells showed reduced homeostatic cytoplasmic Ca 2+ concentration and severe impairment in tonic interferon signaling. Transcriptome analysis showed downregulation of multiple cellular defense mechanisms, including antiviral signaling pathways in ORAI1 knockout cells, which are likely due to reduced expression of the Ca 2+ -dependent transcription factors of the activator protein 1 (AP-1) family and MEF2C . Our results identify a novel role of ORAI1-mediated Ca 2+ signaling in regulating the baseline type I interferon level, which is a determinant of host resistance to SARS-CoV-2 infection.

SARS-CoV-2, responsible for the COVID-19 pandemic, causes respiratory failure and damage to multiple organ systems. The emergence of viral variants poses a risk of vaccine failures and prolongation of the pandemic. However, our understanding of the molecular basis of SARS-CoV-2 infection and subsequent COVID-19 pathophysiology is limited. In this study, we have uncovered a critical role for the evolutionarily conserved Hippo signaling pathway in COVID-19 pathogenesis. Given the complexity of COVID-19 associated cell injury and immunopathogenesis processes, we investigated Hippo pathway dynamics in SARS-CoV-2 infection by utilizing COVID-19 lung samples, and human cell models based on pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) and human primary lung air-liquid interface (ALI) cultures. SARS-CoV-2 infection caused activation of the Hippo signaling pathway in COVID-19 lung and in vitro cultures. Both parental and Delta variant of concern (VOC) strains induced Hippo pathway. The chemical inhibition and gene knockdown of upstream kinases MST1/2 and LATS1 resulted in significantly enhanced SARS-CoV-2 replication, indicating antiviral roles. Verteporfin a pharmacological inhibitor of the Hippo pathway downstream transactivator, YAP, significantly reduced virus replication. These results delineate a direct antiviral role for Hippo signaling in SARS-CoV-2 infection and the potential for this pathway to be pharmacologically targeted to treat COVID-19.

ABSTRACT RNA viruses continue to remain a clear and present threat for potential pandemics due to their rapid evolution. To mitigate their impact, we urgently require antiviral agents that can inhibit multiple families of disease-causing viruses, such as arthropod-borne and respiratory pathogens. Potentiating host antiviral pathways can prevent or limit viral infections before escalating into a major outbreak. Therefore, it is critical to identify broad-spectrum antiviral agents. We have tested a small library of innate immune agonists targeting pathogen recognition receptors, including TLRs, STING, NOD, Dectin and cytosolic DNA or RNA sensors. We observed that TLR3, STING, TLR8 and Dectin-1 ligands inhibited arboviruses, Chikungunya virus (CHIKV), West Nile virus (WNV) and Zika virus, to varying degrees. Cyclic dinucleotide (CDN) STING agonists, such as cAIMP, diABZI, and 2’,3’-cGAMP, and Dectin-1 agonist scleroglucan, demonstrated the most potent, broad-spectrum antiviral function. Comparative transcriptome analysis revealed that CHIKV-infected cells had larger number of differentially expressed genes than of WNV and ZIKV. Furthermore, gene expression analysis showed that cAIMP treatment rescued cells from CHIKV-induced dysregulation of cell repair, immune, and metabolic pathways. In addition, cAIMP provided protection against CHIKV in a CHIKV-arthritis mouse model. Cardioprotective effects of synthetic STING ligands against CHIKV, WNV, SARS-CoV-2 and enterovirus D68 (EV-D68) infections were demonstrated using human cardiomyocytes. Interestingly, the direct-acting antiviral drug remdesivir, a nucleoside analogue, was not effective against CHIKV and WNV, but exhibited potent antiviral effects against SARS-CoV-2, RSV (respiratory syncytial virus), and EV-D68. Our study identifies broad-spectrum antivirals effective against multiple families of pandemic potential RNA viruses, which can be rapidly deployed to prevent or mitigate future pandemics.

Abstract We recently discovered a superantigen-like motif, similar to Staphylococcal enterotoxin B (SEB), near the S1/S2 cleavage site of SARS-CoV-2 Spike protein, which might explain the multisystem-inflammatory syndrome (MIS-C) observed in children and cytokine storm in severe COVID-19 patients. We show here that an anti-SEB monoclonal antibody (mAb), 6D3, can bind this viral motif, and in particular its PRRA insert, to inhibit infection by blocking the access of host cell proteases, TMPRSS2 or furin, to the cleavage site. The high affinity of 6D3 for the furin-cleavage site originates from a poly-acidic segment at its heavy chain CDR2, a feature shared with SARS-CoV-2-neutralizing mAb 4A8. The affinity of 6D3 and 4A8 for this site points to their potential utility as therapeutics for treating COVID-19, MIS-C, or common cold caused by human coronaviruses (HCoVs) that possess a furin-like cleavage site.

SUMMARY SARS-CoV-2 can infect cells through endocytic uptake, a process which can be targeted by inhibition of lysosomal proteases. However, clinically this approach fared poorly with an oral regimen of hydroxychloroquine that was accompanied by significant toxicity due to off-target effects. We rationalized that an organelle-targeted approach will avoid toxicity while increasing the concentration of the drug at the target. Here we describe a lysosome-targeted, mefloquine-loaded poly(glycerol monostearate-co-ε-caprolactone) nanoparticle (MFQ-NP) for pulmonary delivery via inhalation. Mefloquine is a more effective inhibitor of viral endocytosis than hydroxychloroquine in cellular models of COVID-19. MFQ-NPs are less toxic than molecular mefloquine, 100-150 nm in diameter, and possess a negative surface charge which facilitates uptake via endocytosis allowing inhibition of lysosomal proteases. MFQ-NPs inhibit coronavirus infection in mouse MHV-A59 and human OC43 coronavirus model systems and inhibit SARS-CoV-2-WA1 and its Omicron variant in a human lung epithelium model. This study demonstrates that organelle-targeted delivery is an effective means to inhibit viral infection.

Zika virus (ZIKV) is a mosquito borne flavivirus originally confined to Africa and Asia that has spread to islands located in Southeast Asia, and most recently to the Americas and the Caribbean. Approximately 80% of infected individuals are asymptomatic, while the remaining infected population exhibit mild febrile syndrome such as rash, conjunctivitis, and arthralgia. In some adults, ZIKV causes neurotropic Guillain Barré syndrome (1). Vertical transmission of ZIKV in infected mothers causes fetal growth restriction, microcephaly, and congenital eye disease (2-5). Cases of ZIKV sexual transmission from male to female (6-8), male to male (9), and a suspected case of female to male transmission (10) have been reported. ZIKV has been detected in the semen of infected males (11-15), even after months of symptom onset (16-19). Viral persistence in the testes and semen can increase the risk of ZIKV transmission through rectal route in men having sex with men (MSM) and between heterosexual partners. The anorectal mucosa is a major entry site for HIV-1 transmission among MSM (20), and for the acquisition and transmission of other sexually transmitted diseases, such as syphilis, chlamydia, and gonorrhea. Although the risk of ZIKV acquisition through the rectal route is high, no pathobiological information is available. Here, we describe the establishment of a rectal route of ZIKV infection system using immunocompromised (ifnar1 -/-) male mice to determine their susceptibility to ZIKV and to assess viral dissemination to male reproductive organs. We found that rectal inoculation of ZIKV results in viremia with non-lethal infection. The rectal mucosa is susceptible to ZIKV entry and replication. Following rectal inoculation, ZIKV establishes active testicular infection that persists at least 21 days. During the acute phase of infection, the highest viral load was observed in the spleen, with inflammatory and immune cellular infiltration. Macrophages in the splenic red pulp are the target cells for ZIKV infection.