ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVReviewNEXTPaper-Based Microfluidic Devices: Emerging Themes and ApplicationsYuanyuan Yang†, Eka Noviana†, Michael P. Nguyen†, Brian J. Geiss‡, David S. Dandy§, and Charles S. Henry*†§View Author Information† Department of Chemistry, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523, United States‡ Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523, United States§ Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523, United States*E-mail: [email protected]. Phone: +1-970-491-2852.Cite this: Anal. Chem. 2017, 89, 1, 71–91Publication Date (Web):December 7, 2016Publication History Published online12 December 2016Published inissue 3 January 2017https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.6b04581https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b04581review-articleACS PublicationsCopyright © 2016 American Chemical SocietyRequest reuse permissionsArticle Views12459Altmetric-Citations418LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-Alertsclose SUBJECTS:Colorimetry,Electrodes,Metals,Peptides and proteins,Sensors Get e-Alerts

Salmonella causes over a million foodborne illnesses per year in the United States resulting in more hospitalizations and deaths than any other foodborne bacterial pathogen. To help prevent outbreaks, a rapid, portable, sensitive, and reliable method for onsite detection of bacteria that can be used in different sample matrices would be beneficial. Herein, we present a colorimetric paper-based analytical device (PAD) combined with immunomagnetic separation (IMS) for detecting Salmonella typhimurium. IMS anti-Salmonella coated magnetic beads were applied to capture and separate bacteria from the sample matrix and preconcentrate it into small volumes before testing on paper. To directly detect S. typhimurium after IMS, a sandwich immunoassay was implemented into the procedure with β-galactosidase (β-gal) as the detection enzyme. Using the antibody/enzyme complex, we performed a colorimetric assay with chlorophenol red-β-d-galactopyranoside (CPRG) for bacteria quantification. The method was confirmed to be highly specific to S. typhimurium without interference from other pathogenic bacteria like Escherichia coli. Using this system, the limit of detection of S. typhimurium was found to be 102 CFU mL-1 in culturing solution without any pre-enrichment. In addition, distance-based detection where the concentration is read as the length of colored band formed on the reaction was also demonstrated. This assay had a detection limit of 102 CFU mL-1 for S. typhimurium, providing an instrument-free quantitative analysis alternative to spot tests, which require image analysis. Finally, the proposed platform was applied for detection of S. typhimurium in inoculated Starling bird fecal samples and whole milk with detection limits of 105 CFU g-1 and 103 CFU mL-1, respectively, and this is the first published paper-based detection method for S. typhimurium in bird feces and whole milk.

Coronavirus disease-19 (COVID-19) emerged in November, 2019 in China and rapidly became pandemic. As with other coronaviruses, a preponderance of evidence suggests the virus originated in horseshoe bats (Rhinolophus spp.) and likely underwent a recombination event in an intermediate host prior to entry into human populations. A significant concern is that SARS-CoV-2 could become established in secondary reservoir hosts outside of Asia. To assess this potential, we challenged deer mice (Peromyscus maniculatus) with SARS-CoV-2 and found robust virus replication in the upper respiratory tract, lungs and intestines, with detectable viral RNA for up to 21 days in oral swabs and 14 days in lungs. Virus entry into the brain also occurred, likely via gustatory-olfactory-trigeminal pathway with eventual compromise to the blood brain barrier. Despite this, no conspicuous signs of disease were observed and no deer mice succumbed to infection. Expression of several innate immune response genes were elevated in the lungs, notably IFNα, Cxcl10, Oas2, Tbk1 and Pycard. Elevated CD4 and CD8β expression in the lungs was concomitant with Tbx21, IFNγ and IL-21 expression, suggesting a type I inflammatory immune response. Contact transmission occurred from infected to naive deer mice through two passages, showing sustained natural transmission. In the second deer mouse passage, an insertion of 4 amino acids occurred to fixation in the N-terminal domain of the spike protein that is predicted to form a solvent-accessible loop. Subsequent examination of the source virus from BEI Resources indicated the mutation was present at very low levels, demonstrating potent purifying selection for the insert during in vivo passage. Collectively, this work has determined that deer mice are a suitable animal model for the study of SARS-CoV-2 pathogenesis, and that they have the potential to serve as secondary reservoir hosts that could lead to periodic outbreaks of COVID-19 in North America.

Abstract The global COVID-19 pandemic has caused massive disruptions in every society around the world. To help fight COVID-19, new molecular tools specifically targeting critical components of the causative agent of COVID-19, SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), are desperately needed. The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein is a major component of the viral replication processes, integral to viral particle assembly, and is a major diagnostic marker for infection and immune protection. Currently available antibody reagents targeting the nucleocapsid protein were primarily developed against the related SARS-CoV virus and are not specific to SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Therefore, in this work we developed and characterized a series of new mouse monoclonal antibodies against the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. The anti-nucleocapsid monoclonal antibodies were tested in ELISA, western blot, and immunofluorescence analyses. The variable regions from the heavy and light chains from five select clones were cloned and sequenced, and preliminary epitope mapping of the sequenced clones was performed. Overall, the new antibody reagents described here will be of significant value in the fight against COVID-19.

The COVID-19 pandemic pushed the demand for readily available monitoring tools, leading to the development of electrochemical point-of-care devices. This work presents an electrochemical capillary-driven immunoassay (eCaDI) device based on polyethylene terephthalate (PET) and adhesive films featuring a screen-printed carbon electrode (SPCE) for the detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) protein in clinical samples. The SPCE was modified with protein A and capture antibodies (Ab1) to ensure biomolecule immobilization and enhance sensitivity to detect N protein. The eCaDI automates an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) through sequential reagent delivery, allowing for one-step sample addition. This process involves the capture of the N protein by Ab1, followed by the automated delivery of HRP-labelled antibody and 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) followed by electrochemical detection through TMB reduction. The SPCEs are sensitive and selective for SARS-CoV-2 N protein and stable for four weeks. Inactivated virus was used to determine a limit of detection (LOD) of 627 PFU/mL. The results obtained through immunoassay on eCADI were consistent with those of the RT-PCR method, showing a coefficient of determination (R2) of 0.816 for 27 nasal swab samples from SARS-CoV-2 infected individuals. The developed eCADI is an alternative to conventional ELISA, given the device's low cost (less than $1), low consumption of samples and reagents, low waste generation, and short analysis time (5 min). Moreover, the immunoassay has shown potential for diagnosing COVID-19 in decentralized areas.

ABSTRACT The unwinding of double-stranded RNA intermediates is critical for replication and packaging of flavivirus RNA genomes. This unwinding activity is achieved by the ATP-dependent nonstructural protein 3 (NS3) helicase. In previous studies, we investigated the mechanism of energy transduction between the ATP and RNA binding pockets using molecular dynamics simulations and enzymatic characterization. Our data corroborated the hypothesis that Motif V is a communication hub for this energy transduction. More specifically, mutations T407A and S411A in Motif V exhibit a hyperactive helicase phenotype leading to the regulation of translocation and unwinding during replication. However, the effect of these mutations on viral infection in cell culture and in vivo is not well understood. Here, we investigated the role of Motif V in viral replication using T407A and S411A West Nile virus (Kunjin subtype) mutants in cell culture and in vivo. We were able to recover S411A Kunjin but unable to recover T407A Kunjin. Our results indicated that S411A Kunjin decreased viral infection, and increased cytopathogenicity in cell culture as compared to WT Kunjin. Similarly, decreased infection rates in surviving S411A-infected Culex quinquefasciatus mosquitoes were observed, but S411A Kunjin infection resulted in increased mortality compared to WT Kunjin. Additionally, S411A Kunjin increased viral dissemination and saliva positivity rates in surviving mosquitoes compared to WT Kunjin. These data suggest that S411A Kunjin increases pathogenesis in mosquitoes. Overall, these data indicate that NS3 Motif V may play a role in the pathogenesis, dissemination, and transmission efficiency of Kunjin virus. IMPORTANCE Kunjin and West Nile viruses belong to the arthropod-borne flaviviruses, which can result in severe symptoms including encephalitis, meningitis, and death. Flaviviruses have expanded into new populations and emerged as novel pathogens repeatedly in recent years demonstrating they remain a global threat. Currently, there are no approved anti-viral therapeutics against either Kunjin or West Nile viruses. Thus, there is a pressing need for understanding the pathogenesis of these viruses in humans. In this study, we investigate the role of the Kunjin virus helicase on infection in cell culture and in vivo . This work provides new insight into how flaviviruses control pathogenesis and mosquito transmission through the nonstructural protein 3 helicase.

West Nile virus (WNV) is the most prevalent mosquito-borne virus and the leading cause of viral encephalitis in the continental United States. It belongs to the family Flaviviridae which includes other important human pathogens such as dengue virus (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV) and Zika viruses (ZIKV). Despite several decades of research, no specific antiviral drugs are available to treat flavivirus infections. The present study characterizes the interaction between the WNV NS3 and NS5 proteins for the purpose of identifying hotspots in the protein-protein interaction which could be targeted for the development of antiviral therapeutics. We previously developed an interaction model in silico based on data available in the literature. Here, potential interacting residues on NS3 and NS5 were mutated in a WNV replicon, and seven mutations in the NS3 protein were found to drastically reduce viral replication. In addition to being well conserved among mosquito-borne flaviviruses, these residues are located on the protein’s surface in two clusters which might be interesting new targets for future drug development.

Abstract Defining the binding epitopes of antibodies is essential for understanding how they bind to their antigens and perform their molecular functions. However, while determining linear epitopes of monoclonal antibodies can be accomplished utilizing well-established empirical procedures, these approaches are generally labor-and time-intensive and costly. To take advantage of the recent advances in protein structure prediction algorithms available to the scientific community, we developed a calculation pipeline based on the localColabFold implementation of AlphaFold2 that can predict linear antibody epitopes by predicting the structure of the complex between antibody heavy and light chains and target peptide sequences derived from antigens. We found that this AlphaFold2 pipeline, which we call PAbFold, was able to accurately flag known epitope sequences for several well-known antibody targets (HA / Myc) when the target sequence was broken into small overlapping linear peptides and antibody complementarity determining regions (CDRs) were grafted onto several different antibody framework regions in the single-chain antibody fragment (scFv) format. To determine if this pipeline was able to identify the epitope of a novel antibody with no structural information publicly available, we determined the epitope of a novel anti-SARS-CoV-2 nucleocapsid targeted antibody using our method and then experimentally validated our computational results using peptide competition ELISA assays. These results indicate that the AlphaFold2-based PAbFold pipeline we developed is capable of accurately identifying linear antibody epitopes in a short time using just antibody and target protein sequences. This emergent capability of the method is sensitive to methodological details such as peptide length, AlphaFold2 neural network versions, and multiple-sequence alignment database. PAbFold is available at https://github.com/jbderoo/PAbFold .