Abstract Soluble aggregates of amyloid-β (Aβ), often called oligomers, are believed to be principal drivers of neurotoxicity, spreading of pathology, and symptoms in Alzheimer’s disease (AD), but little is known about their structures in human brain. Aβ oligomers have been defined as aggregates found in supernatants following ultracentrifugation of aqueous extracts. We now report the unexpected presence of abundant Aβ fibrils in high-speed supernatants from AD brains that were extracted by soaking in aqueous buffer. The fibrils did not appear to form during extract preparation, and their numbers by EM correlated with ELISA quantification of aggregated Aβ 42 . Cryo-EM structures of Aβ fibrils from aqueous extracts were identical to those from sarkosyl-insoluble AD brain homogenates. The fibrils in aqueous extracts were immunolabeled by lecanemab, an Aβ aggregate-directed antibody reported to improve cognitive outcomes in AD. We conclude that Aβ fibrils are abundant in aqueous extracts from AD brains and have the same structures as those from amyloid plaques. These findings have implications for understanding the nature of Aβ oligomers and for designing oligomer-preferring therapeutic antibodies.

Abstract Background Marijuana is the third most commonly used drug in the USA and efforts to legalize it for medical and recreational use are growing. Despite the increase in use, marijuana’s effect on aging remains understudied and understanding the effects of marijuana on molecular aging may provide novel insights into the role of marijuana in the aging process. We therefore sought to investigate the association between cumulative and recent use of marijuana with epigenetic age acceleration (EAA) as estimated from blood DNA methylation. Results A random subset of participants from The Coronary Artery Risk Development in Young Adults (CARDIA) Study with available whole blood at examination years (Y) 15 and Y20 underwent epigenomic profiling. Four EAA estimates (intrinsic epigenetic age acceleration, extrinsic epigenetic age acceleration, PhenoAge acceleration, and GrimAge acceleration) were calculated from DNA methylation levels measured at Y15 and Y20. Ever use and cumulative marijuana-years were calculated from the baseline visit to Y15 and Y20, and recent marijuana use (both any and number of days of use in the last 30 days) were calculated at Y15 and Y20. Ever use of marijuana and each additional marijuana-year were associated with a 6-month ( P < 0.001) and a 2.5-month ( P < 0.001) higher average in GrimAge acceleration (GAA) using generalized estimating equations, respectively. Recent use and each additional day of recent use were associated with a 20-month ( P < 0.001) and a 1-month ( P < 0.001) higher GAA, respectively. A statistical interaction between marijuana-years and alcohol consumption on GAA was observed ( P = 0.011), with nondrinkers exhibiting a higher GAA ( β = 0.21 [95% CI 0.05, 0.36], P = 0.008) compared to heavy drinkers ( β = 0.05 [95% CI − 0.09, 0.18], P = 0.500) per each additional marijuana-year. No associations were observed for the remaining EAA estimates. Conclusions These findings suggest cumulative and recent marijuana use are associated with age-related epigenetic changes that are related to lifespan. These observed associations may be modified by alcohol consumption. Given the increase in use and legalization, these findings provide novel insight on the effect of marijuana use on the aging process as captured through blood DNA methylation.

ABSTRACT Despite of scRNA-seq analytic algorithms developed, their performance for cell clustering cannot be quantified due to the unknown “true” clusters. Referencing the transcriptomic heterogeneity of cell clusters, a “true” mRNA number matrix of cell individuals was defined as ground truth. Based on the matrix and real data generation procedure, a simulation program (SSCRNA) for raw data was developed. Subsequently, the consistence between simulated data and real data was evaluated. Furthermore, the impact of sequencing depth, and algorithms for analyses on cluster accuracy was quantified. As a result, the simulation result is highly consistent with that of the real data. It is found that mis-classification rate can be attributed to multiple reasons on current scRNA platforms, and clustering accuracy is not only sensitive to sequencing depth increasement, but can also be reflected by the position of the cluster on TSNE plot. Among the clustering algorithms, Gaussian normalization method is more appropriate for current workflows. In the clustering algorithms, k-means&louvain clustering method performs better in dimension reduced data than full data, while k-means clustering method is stable under both situations. In conclusion, the scRNA simulation algorithm developed restores the real data generation process, discovered impact of parameters on mis-clustering, compared the normalization/clustering algorithms and provided novel insight into scRNA analyses.

Abstract Hepatic fibrosis (HF) is a very common condition seen in millions of patients with various liver diseases. N 6 -methyladenosine (m 6 A) plays critical roles in various biological and pathological processes. However, the role of m 6 A and its main methyltransferase METTL3 in HF remains obscure. Here, we reported that METTL3 expression was elevated in HSCs from CCl4 induced fibrotic liver. METTL3 knockdown in HSCs mediated by recombinant adeno-associated-virus serotype 9 packed short hairpin RNA against METTL3 alleviated liver injury and fibrosis compared to empty carrier group. Mechanistically, the decreased liver fibrosis in CCl4-treated HSC-specific METTL3 knockdown mice was due to the increased GPR161 that is a suppressor of Hedgehog pathway, a well-known pathway to activate in liver injury and regeneration. As expect, GPR161 transferred into HSCs alleviated liver fibrosis and HSC activation. Forced GPR161 expression inhibited Gli3 activated form nuclear accumulation and subsequently suppressed fibrosis-associate gene expression. Conclusion, HSC-specific deletion of METTL3 inhibits liver fibrosis via elevated GPR161 expression, which subsequently suppressed Hedgehog pathway activation and fibrosis-associated genes expression, providing novel therapeutic targets for HF therapy. Synopsis The role of RNA m 6 A methyltransferase METTL3 in the progression of hepatic fibrosis is unclear. Here, we reveal that suppresses m 6 A modification by depletion of METTL3 in Hepatic Stellate Cells (HSCs), stabilizes the GPR161 transcripts, that involved in suppressing Hedgehog signaling pathway, through YTHDF2, thereby alleviating the fibrosis feature of CCl4-induced liver injury. Disruption of m 6 A methyltransferases METTL3 in HSCs alleviates liver fibrosis feature. METTL3 depletion in liver HSCs suppresses its activation by suppressing Hedgehog signaling pathway through stabilizing GPR161 transcripts in an m 6 A-YTHDF2 dependent manner. GPR161 activates PKA that mediates phosphorylation and degradation of full-length Gli3 (Gli3-FL) protein, then the short Gli3 (Gli3-R) translocated into the nucleus and suppresses the fibrosis associated gene transcription. The elevated METTL3 expression is attribute to its promoter H3K27ac modification.

Abstract Transposable elements (TEs) are an extensive source of genetic polymorphisms and play an indispensable role in chromatin architecture, transcriptional regulatory networks, and genomic evolution. The pig is an important source of animal protein and serves as a biomedical model for humans, yet the functional role of TEs in pigs and their contributions to complex traits are largely unknown. Here, we built a comprehensive catalog of TEs (n = 3,087,929) in pigs by a newly developed pipeline. Through integrating multi-omics data from 21 tissues, we found that SINEs with different ages were significantly associated with genomic regions with distinct functions across tissues. The majority of young SINEs were predominantly silenced by histone modifications, DNA methylation, and decreased accessibility. However, the expression of transcripts that were derived from the remaining active young SINEs exhibited strong tissue specificity through cross-examining 3,570 RNA-seq from 79 tissues and cell types. Furthermore, we detected 211,067 polymorphic SINEs (polySINEs) in 374 individuals genome-wide and found that they clearly recapitulated known patterns of population admixture in pigs. Out of them, 340 population-specific polySINEs were associated with local adaptation. Mapping these polySINEs to genome-wide associations of 97 complex traits in pigs, we found 54 candidate genes (e.g., ANK2 and VRTN ) that might be mediated by TEs. Our findings highlight the important roles of young SINEs in functional genomics and provide a supplement for genotype-to-phenotype associations and modern breeding in pigs.

Abstracts The DNA damage repair regulatory protein RNF168, a monomeric RING-type E3 ligase, plays a crucial role in regulating cell fate and DNA repair by specific and efficient ubiquitination of the adjacent Lys13 and Lys15 sites at the H2A N-terminal tail. However, understanding how RNF168 coordinates with its cognate E2 enzyme UbcH5c to ubiquitinate H2AK13/15 site-specifically has long been hampered by the lack of high-resolution structures of RNF168 and UbcH5c∼Ub in complex with nucleosomes. Here, we developed mechanism-based chemical trapping strategies and determined the cryo-EM structures of the RNF168/UbcH5c–Ub/NCP complex captured in transient H2AK13/15 monoubiquitination and adjacent dual-monoubiquitination reactions. Our structural analysis revealed that RNF168 stably binds to the nucleosomal H2A–H2B acidic patch through a basic helix with multiple interactions, which positions the UbcH5c active centre directly over the H2A N-terminus, providing a “helix-anchoring” mode for monomeric E3 ligase RNF168 on nucleosome in contrast to the “compass-binding” mode of dimeric E3 ligases. Furthermore, our chemically synthesized ubiquitinated histones have enabled the elucidation of the efficiency of Ub installation and the interplay between the initial and subsequent Ub modifications on the adjacent H2A K13 and K15 sites. Overall, our work not only provides structural snapshots of H2A K13/K15 site-specific monoubiquitination and adjacent dual-monoubiquitination, but also offers a near-atomic resolution structural framework for understanding how pathogenic mutations or physiological modifications affect the molecular function of RNF168 in H2A K13/15 ubiquitination.

Abstract p97 processes ubiquitinated substrates and plays a central role in cellular protein homeostasis. Previous studies have showed that it is a potential drug target for cancer, neurodegenerative disease, and viral infections. Here, we report a series of cryo-electron microscopy (cryo-EM) structures of substrate-engaged human p97 complex that captured “power stroke”-like motions of both the D1 and D2 ATPase rings of p97. A key feature of these structures is the critical conformational changes of the inter-subunit signaling (ISS) motifs, which tightens the binding of nucleotides and neighboring subunits, and contributes to the spiral staircase conformation of the D1 and D2 rings. We further determined the cryo-EM structure of human p97 in complex with NMS-873, the most potent p97 inhibitor. The structures showed that NMS-873 binds at a cryptic groove in the D2 domain and interacts with the ISS motif, preventing its conformational change, thus blocking substrate translocation allosterically.

Converging studies showed interstitial fluid (ISF) adjacent to blood vessels flows along adventitia of vasculature into heart and lungs. We aim to reveal circulatory pathways and regulatory mechanism of such adventitial ISF flow in rat model. By MRI, real-time fluorescent imaging, micro-CT and histological analysis, ISF was found to flow in adventitial matrix surrounded by fascia and along systemic vessels into heart, then flow into lungs via pulmonary arteries and back to heart via pulmonary veins, which was neither perivascular tissues nor blood or lymphatic vessels. Under physiological conditions, speckle-like adventitial ISF flow rate was positively correlated with heart rate, increased when holding breath, became pulsative during heavy breathing. During cardiac or respiratory cycle, each dilation or contraction of heart or lungs can generate to-and-fro adventitial ISF flow along femoral veins. Discovered regulatory mechanisms of adventitial ISF flow along vasculature by heart and lungs will revolutionize understanding of cardiovascular system.

Abstract Protein ubiquitination shows remarkable topological and functional diversity through the polymerization of ubiquitin via different linkages. Deciphering the cellular ubiquitin code is of central importance to understand the physiology of the cell. Among the eight possible linkages, K29-linked polyubiquitin is a relatively abundant type of polyubiquitin in both human and yeast cells. However, our understanding of its function is rather limited due to the lack of specific binders as tools to detect K29-linked polyubiquitin. In this study, we screened and characterized a synthetic antigen-binding fragment, termed sAB-K29, that can specifically recognize K29-linked polyubiquitin using chemically synthesized K29-linked diubiquitin. We further determined the crystal structure of this fragment bound to the K29-linked diubiquitin, which revealed the molecular basis of specificity. Using sAB-K29 as a tool, we uncovered that K29-linked ubiquitination is involved in different kinds of cellular proteotoxic stress response as well as cell cycle regulation. In particular, we showed that K29-linked ubiquitination is enriched in the midbody and downregulation of the K29-linked ubiquitination signal arrests cells in G1/S phase.

Abstract Increased de novo lipogenesis (DNL) is a hallmark of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in obesity, but the macronutrient source for >80% carbon backbone for fatty acid synthesis has not been determined. Here we take an integrated approach to dissect nutrient metabolism, both ex vivo and in vivo . We discover a castling effect of glucose and glutamine metabolism through ex vivo isotope tracing studies that limits the entrance of glucose carbon into the glutamine-dominated tricarboxylic acid cycle (TCA) and DNL pathways. In vivo tracing studies with a high carbohydrate drink (glucose/amino acid, 3:1, w/w ) confirm dietary amino acids are twice more efficient than glucose in labeling the hepatic acetyl-CoA and fatty acid pool, and together they account for over 70% of hepatic DNL substrate. Both glucose and glutamine carbon flux into DNL pathways are increased in obese hepatocytes, and metabolic rerouting of substrate carbon toward glycogen synthesis and energy production through GYS2 and GLUD1 overexpression improves hepatic steatosis. Together, these data reveal the quantitative contribution of glucose and amino acid carbon toward hepatic DNL and the development of hepatic steatosis in obesity.