Abstract Programmable and multiplexed genome integration of large, diverse DNA cargo independent of DNA repair remains an unsolved challenge of genome editing. Current gene integration approaches require double-strand breaks that evoke DNA damage responses and rely on repair pathways that are inactive in terminally differentiated cells. Furthermore, CRISPR-based approaches that bypass double stranded breaks, such as Prime editing, are limited to modification or insertion of short sequences. We present Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements, or PASTE, which achieves efficient and versatile gene integration at diverse loci by directing insertion with a CRISPR-Cas9 nickase fused to both a reverse transcriptase and serine integrase. Without generating double stranded breaks, we demonstrate integration of sequences as large as ∼36 kb with rates between 10-50% at multiple genomic loci across three human cell lines, primary T cells, and quiescent non-dividing primary human hepatocytes. To further improve PASTE, we discover thousands of novel serine integrases and cognate attachment sites from metagenomes and engineer active orthologs for high-efficiency integration using PASTE. We apply PASTE to fluorescent tagging of proteins, integration of therapeutically relevant genes, and production and secretion of transgenes. Leveraging the orthogonality of serine integrases, we engineer PASTE for multiplexed gene integration, simultaneously integrating three different genes at three genomic loci. PASTE has editing efficiencies comparable to or better than those of homology directed repair or non-homologous end joining based integration, with activity in non-dividing cells and fewer detectable off-target events. For therapeutic applications, PASTE can be delivered as mRNA with synthetically modified guides to programmably direct insertion of DNA templates carried by AAV or adenoviral vectors. PASTE expands the capabilities of genome editing via drag-and-drop gene integration, offering a platform with wide applicability for research, cell engineering, and gene therapy. One Sentence Summary A new technology combining CRISPR-mediated genome editing and site-specific integrases enables efficient programmable gene integration at any targeted genomic locus without double-strand DNA breaks, leading to broad applications in basic science research, cell engineering, and gene therapy.

Abstract The diversity of cell types and states can be scalably measured and defined by expressed RNA transcripts. However, approaches to programmably sense and respond to the presence of specific RNAs within living biological systems with high sensitivity are lacking. RNA sensors that gate expression of reporter or cargo genes would have diverse applications for basic biology, diagnostics and therapeutics by enabling cell-state specific control of transgene expression. Here, we engineer a novel programmable RNA-sensing technology, Reprogrammable ADAR Sensors (RADARS), which leverages RNA editing by adenosine deaminases acting on RNA (ADAR) to gate translation of a protein payload on the presence of endogenous RNA transcripts. In mammalian cells, we engineer RADARS with diverse payloads, including luciferase and fluorescent proteins, with up to 164-fold activation and quantitative detection in the presence of target RNAs. We show RADARS are functional either expressed from DNA or as synthetic mRNA. Importantly, RADARS can function with endogenous cellular ADAR. We apply RADARS to multiple contexts, including RNA-sensing induced cell death via caspases, cell type identification, and in vivo control of synthetic mRNA translation, demonstrating RADARS as a tool with significant potential for gene and cell therapy, synthetic biology, and biomedical research. One Sentence Summary A new technology utilizing ADAR mediated RNA-editing enables robust reprogrammable protein expression based on target RNA transcripts in mammalian cells, leading to broad applications in basic science research, cell engineering, and gene therapy.

Abstract The type III-E Cas7-11 effector nuclease forms a complex with a CRISPR RNA (crRNA) and the putative caspase-like protease Csx29, catalyzes crRNA-guided target RNA cleavage, and has been used for RNA targeting in eukaryotic cells. Here, we report cryo-electron microscopy structures of the Cas7-11–crRNA–Csx29 complex with and without target RNA, and demonstrate that target RNA binding induces a conformational change in Csx29 and results in the protease activation. Biochemical analysis confirmed that Cas7-11-bound Csx29 cleaves Csx30 in a target RNA-dependent manner. Reconstitution of the system in bacteria uncovered Csx30-dependent cellular toxicity regulated by Csx31, and that Csx29-mediated cleavage produces toxic Csx30 fragments, promoting cell death. We find that Csx30 can bind both Csx31 and the associated sigma factor RpoE, suggesting Csx30 can inhibit RpoE and modulate cellular stress response towards infection. Overall, the RNA-guided nuclease-protease activities of the Cas7-11–Csx29 effector complex facilitate protease-based programmed cell death.

Abstract Background Previously, a chronic social defeat stress (CSDS) model has been widely‐adopted for assessing depressive‐like behaviors in animals. However, there is still room for improvement in the CSDS model to safeguard study accuracy and the welfare of lab rodents. Our study team developed a novel, standardized apparatus to induce CSDS in rodents and assessed the model's practical adaptability. Methods An innovative CSDS cage apparatus and water bottle was designed. To evaluate the effectiveness of the newly developed tools, a variety of animal models, including the tail suspension test (TST), sucrose preference test, forced swimming test (FST), novelty‐suppressed feeding test, female urine sniffing test, and open field test (OFT), were adopted to assess depressive‐like behaviors in mice. Fluoxetine treatment was also administered to observe the reversal effect, as part of the validation. Results The CSDS cage apparatus resulted in the manifestation of depressive‐like behaviors in the model mice. Significant reductions in sucrose preference and urine sniffing time were observed, while the OFT revealed decreased central zone total distance, residence time, and frequency of entry. Moreover, increased immobility was found in the FST and TST. Fluoxetine treatment was found to successfully reverse the modeling effect. Conclusion The CSDS cage apparatus was validated for enhanced usability and addressed the previous challenges of water bottle leakage and lab rodent welfare issues. The consistent results from multiple behavioral tests also supported real‐world application of the apparatus, offering researchers a promising alternative to conventional rodent cages.

Serratia marcescens outbreaks present significant challenges in clinical treatment, necessitating a deeper understanding of its epidemiological and genomic traits.

Abstract Antimicrobial resistance poses a significant threat to global public health, especially for Enterobacterales. In this study, we investigated the distribution and antimicrobial resistance of Enterobacterales in children in the China Antimicrobial Surveillance Network (CHINET) in 2015–2021. In total, 81,681 strains isolated from children were collected in this period, accounting for 50.1% of Gram-negative organisms. The most frequently isolated Enterobacterales were Escherichia coli , Klebsiella spp., Salmonella spp., and Enterobacter spp. The main sources of the isolates were urine and the respiratory tract, accounting for 29.3% and 27.7% of isolates, respectively. The proportions of E. coli , Klebsiella pneumoniae , and Proteus mirabilis expressing extended-spectrum β-lactamase were 48.8%–57.6%, 49.3%–66.7%, and 23.1%–33.8%, respectively. The prevalence of carbapenem-resistant Enterobacterales was 5.7%–9.5%, which showed a decreasing trend from 2015 to 2021. The detection rates of carbapenem-resistant Klebsiella spp., carbapenem-resistant Enterobacter spp., and carbapenem-resistant E. coli were 14.1%–22.6%, 7.1%–15.7% and 2.0%–3.4%, respectively. In Enterobacterales, the resistance rates to ciprofloxacin were higher than to levofloxacin. However, the Enterobacterales strains were highly susceptible to amikacin, polymyxin B, and tigecycline. The resistance rate of Salmonella spp. to ampicillin was > 70%, whereas their resistance rate to ceftriaxone was < 30%. These findings indicate that the resistant rates of some Enterobacterales isolates in children to common antimicrobial agents show decreasing trends. Continuous monitoring of bacterial resistance should be strengthened to prevent and control the spread of drug-resistant bacteria.

We developed a new method for conditional regulation of CRISPR/Cas9 activity in mammalian cells and zebrafish embryos via photochemically activated, caged guide RNAs. Caged gRNAs are generated by substituting four nucleobases evenly distributed throughout the 5'-protospacer region with caged nucleobases during synthesis. Caging confers complete suppression of gRNA:target dsDNA hybridization and rapid restoration of CRISPR/Cas9 function upon optical activation. This tool offers simplicity and complete programmability in design, high spatiotemporal specificity in cells and zebrafish embryos, excellent off to on switching, and stability by preserving the ability to form Cas9:gRNA ribonucleoprotein complexes. caged gRNAs are novel tools for conditional control of gene editing thereby enabling the investigation of spatiotemporally complex physiological events by obtaining a better understanding of dynamic gene regulation.