The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus enters host cells via an interaction between its Spike protein and the host cell receptor angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). By screening a yeast surface-displayed library of synthetic nanobody sequences, we developed nanobodies that disrupt the interaction between Spike and ACE2. Cryo-electron microscopy (cryo-EM) revealed that one nanobody, Nb6, binds Spike in a fully inactive conformation with its receptor binding domains locked into their inaccessible down state, incapable of binding ACE2. Affinity maturation and structure-guided design of multivalency yielded a trivalent nanobody, mNb6-tri, with femtomolar affinity for Spike and picomolar neutralization of SARS-CoV-2 infection. mNb6-tri retains function after aerosolization, lyophilization, and heat treatment, which enables aerosol-mediated delivery of this potent neutralizer directly to the airway epithelia.

The SARS-CoV-2 protein Nsp2 has been implicated in a wide range of viral processes, but its exact functions, and the structural basis of those functions, remain unknown. Here, we report an atomic model for full-length Nsp2 obtained by combining cryo-electron microscopy with deep learning-based structure prediction from AlphaFold2. The resulting structure reveals a highly-conserved zinc ion-binding site, suggesting a role for Nsp2 in RNA binding. Mapping emerging mutations from variants of SARS-CoV-2 on the resulting structure shows potential host-Nsp2 interaction regions. Using structural analysis together with affinity tagged purification mass spectrometry experiments, we identify Nsp2 mutants that are unable to interact with the actin-nucleation-promoting WASH protein complex or with GIGYF2, an inhibitor of translation initiation and modulator of ribosome-associated quality control. Our work suggests a potential role of Nsp2 in linking viral transcription within the viral replication-transcription complexes (RTC) to the translation initiation of the viral message. Collectively, the structure reported here, combined with mutant interaction mapping, provides a foundation for functional studies of this evolutionary conserved coronavirus protein and may assist future drug design.

Without an effective prophylactic solution, infections from SARS-CoV-2 continue to rise worldwide with devastating health and economic costs. SARS-CoV-2 gains entry into host cells via an interaction between its Spike protein and the host cell receptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2). Disruption of this interaction confers potent neutralization of viral entry, providing an avenue for vaccine design and for therapeutic antibodies. Here, we develop single-domain antibodies (nanobodies) that potently disrupt the interaction between the SARS-CoV-2 Spike and ACE2. By screening a yeast surface-displayed library of synthetic nanobody sequences, we identified a panel of nanobodies that bind to multiple epitopes on Spike and block ACE2 interaction via two distinct mechanisms. Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) revealed that one exceptionally stable nanobody, Nb6, binds Spike in a fully inactive conformation with its receptor binding domains (RBDs) locked into their inaccessible down-state, incapable of binding ACE2. Affinity maturation and structure-guided design of multivalency yielded a trivalent nanobody, mNb6-tri, with femtomolar affinity for SARS-CoV-2 Spike and picomolar neutralization of SARS-CoV-2 infection. mNb6-tri retains stability and function after aerosolization, lyophilization, and heat treatment. These properties may enable aerosol-mediated delivery of this potent neutralizer directly to the airway epithelia, promising to yield a widely deployable, patient-friendly prophylactic and/or early infection therapeutic agent to stem the worst pandemic in a century.

Abstract The complex eukaryotic chaperonin TRiC/CCT helps maintain cellular protein homeostasis, however, its assembly mechanism remains largely unknown. To address the subunit specificity in TRiC assembly, we express each of the individual yeast TRiC subunit in E. coli . Our cryo-EM structural study and biochemical analyses demonstrate that CCT1/2/6 can form TRiC-like homo-oligomeric double ring (HR) complex, however ATP-hydrolysis cannot trigger their ring closure; after deletion of the long N-terminal extension, CCT5 can form the closed double-ring structure; while CCT3/4/7/8 cannot form the HRs. It appears that CCT1 forms a HR in a unique spiral configuration, and ATP-hydrolysis can drive it to re-assemble with an inserted extra subunit-pair. Our data suggest that CCT5 could be the leading subunit in ATP-hydrolysis-driven TRiC ring closure. Moreover, we demonstrate that ADP is sufficient to trigger the assembly of the HRs and TRiC from the assembly intermediate micro-complex form. Our study reveals that through evolution, the more ancestral subunits may have evolved to take more responsibilities in TRiC ring assembly, and we propose a possible assembly mechanism of TRiC involving subunit-pair insertion. Collectively, our study gives hints on the structural basis of subunit specificity in TRiC assembly and cooperativity, beneficial for future TRiC-related therapeutic strategy development.

Abstract Dysregulation of the gut microbiota often leads to immune‐related disorders, indigestion, or diarrhea. Here, Jiaxing Black (JXB) pig, a local Chinese pig breed known for its great tolerance and digestibility of nutrients, was employed for a metagenomic and transcriptomic integrative analysis to reveal the gut microbiota‐genes and gut microbiota‐pathway interactions. A total of 452 differentially expressed genes, and 174 phyla were found between the JXB and the Duroc × Landrace × Yorkshire (DLY) pigs. Detailed analysis revealed that the differences in colon gene expression signatures between the JXB and DLY are mainly enriched in metabolic and inflammatory responses, with Lactobacillus and Lachnospiraceae enriched in DLY and JXB, respectively. Notably, Pacebacteria, Streptophyta, and Aerophobetes were found to participate in the PI3K‐Akt mediated immune response in both pig breeds; however, they only accelerated the metabolism in the intestines of JXB pigs. Moreover, the host could regulate microbe metabolism and immune response by Ig‐like domain‐containing protein and ITIH2 , PAEP , and TDRD9 , respectively. Taken together, our results revealed both common and breed‐specific regulations of host genes by gut microbiota in two pig breeds.

Abstract The eukaryotic chaperonin TRiC/CCT assists the folding of about 10% of cytosolic proteins through an ATP-driven conformational cycle, and the essential cytoskeleton protein tubulin is the obligate substrate of TRiC. Here, we present an ensemble of cryo-EM structures of human TRiC throughout its ATPase cycle, with three of them revealing endogenously engaged tubulin in different folding stages. Our structural and XL-MS analyses suggested a gradual upward translocation and stabilization of tubulin within the TRiC chamber accompanying TRiC ring closure. Remarkably, in the closed TRiC-tubulin-S3 map resolved to 3.1-Å-resolution, we captured a near-natively folded tubulin. We found the near-natively folded tubulin engaging through its N and C domains mainly with the A and I domains of the CCT3/6/8 subunits through electrostatic and hydrophilic interactions, while the tubulin I domain was found to remain dynamic. Moreover, we also showed the potential role of TRiC C-terminal tails in substrate stabilization and folding. Our study delineates the pathway and molecular mechanism of TRiC-mediated tubulin folding conjugated with TRiC ATPase cycle, and may also inform the design of therapeutic agents targeting TRiC-tubulin interactions.

Abstract The eukaryotic chaperonin TRiC/CCT assists the folding of ~10% cytosolic proteins. The essential cytoskeletal proteins tubulin and actin are the obligate substrates of TRiC and their folding involves cochaperone and co-factors. Here, through cryo-EM analysis, we present a more complete picture of yeast TRiC-assisted tubulin and actin folding in the ATPase-cycle, under the coordination of cochaperone plp2. Our structures revealed that in the open C1 and C2 states, plp2 and substrates tubulin/actin engage with TRiC inside its chamber, one per ring. Noteworthy, we captured a ternary TRiC-plp2-tubulin complex in the closed C3 state, engaged with a full-length β-tubulin in the native folded state even loaded with a GTP, and with a plp2 occupying the opposite ring, not reported before. Another closed C4 state revealed an actin in the intermediate state of folding and a plp2 occupying the other ring. Intriguingly, along with TRiC ring closure, we captured a large translocation of plp2 within TRiC chamber coordinating substrate translocation on the CCT6 hemisphere, potentially facilitating substrate stabilization and folding. Our findings provide structural insights into the folding mechanism of the major cytoskeletal proteins tubulin/actin under the coordination of the complex biogenesis machinery TRiC and plp2, and could extend our understanding on the links between cytoskeletal proteostasis and related human diseases.

Abstract mTORC2 is a multi-subunit kinase complex that is central to multiple essential signaling pathways. Two core subunits, Rictor and mSin1 distinguish it from its relative, mTORC1 and support context-dependent phosphorylation of its substrates. mTORC2 structures have been determined previously, however, important questions remain, particularly regarding structural determinants of substrate specificity and context dependent activities. We used cryo-EM to obtain high resolution structures of the human mTORC2 apo-complex, as well as structures in the presence of substrates, Akt and SGK1. Specific predictions suggested by substrate-induced structural changes were tested in functional assays. First, side chain interactions between Rictor and mTOR that prevent recruitment of mTORC1 substrates and confer resistance to the mTORC1 inhibitor rapamycin were visualized for the first time in the apo-state, demonstrating the steric occlusion that prevents mTORC2 interaction with mTORC1 substrates and rapamycin. Also in the apo-state, mSin1 was seen to form extensive contacts with Rictor, including a pair of short α-helices nestled between two Rictor helical repeat clusters, followed by an extended strand, which makes multiple weak contacts with Rictor helical cluster 1. In co-complex structures, SGK1, but not Akt, markedly altered the conformation of the mSin1 N-terminal extended strand, disrupting multiple weak interactions while inducing a large rotation of mSin1/Arg-83, which comes to interact with a negative patch within Rictor. Mutation of Arg-83 to Ala selectively disrupted mTORC2 dependent phosphorylation of SGK1 but not of Akt, supporting context-dependent substrate selection. These findings provide new structural and functional insights into mTORC2 specificity and context-dependent activities.

Arrestins comprise a family of signal regulators of G-protein-coupled receptors (GPCRs), which include arrestins 1 to 4. While arrestins 1 and 4 are visual arrestins dedicated to rhodopsin, arrestins 2 and 3 (Arr2 and Arr3) are β-arrestins known to regulate many nonvisual GPCRs. The dynamic and promiscuous coupling of Arr2 to nonvisual GPCRs has posed technical challenges to tackle the basis of arrestin binding to GPCRs. Here we report the structure of Arr2 in complex with neurotensin receptor 1 (NTSR1), which reveals an overall assembly that is strikingly different from the visual arrestin-rhodopsin complex by a 90° rotation of Arr2 relative to the receptor. In this new configuration, intracellular loop 3 (ICL3) and transmembrane helix 6 (TM6) of the receptor are oriented toward the N-terminal domain of the arrestin, making it possible for GPCRs that lack the C-terminal tail to couple Arr2 through their ICL3. Molecular dynamics simulation and crosslinking data further support the assembly of the Arr2‒NTSR1 complex. Sequence analysis and homology modeling suggest that the Arr2‒NTSR1 complex structure may provide an alternative template for modeling arrestin-GPCR interactions.