Xenografts from genetically modified pigs have become one of the most promising solutions to the dearth of human organs available for transplantation. The challenge in this model has been hyperacute rejection. To avoid this, pigs have been bred with a knockout of the alpha-1,3-galactosyltransferase gene and with subcapsular autologous thymic tissue.We transplanted kidneys from these genetically modified pigs into two brain-dead human recipients whose circulatory and respiratory activity was maintained on ventilators for the duration of the study. We performed serial biopsies and monitored the urine output and kinetic estimated glomerular filtration rate (eGFR) to assess renal function and xenograft rejection.The xenograft in both recipients began to make urine within moments after reperfusion. Over the 54-hour study, the kinetic eGFR increased from 23 ml per minute per 1.73 m2 of body-surface area before transplantation to 62 ml per minute per 1.73 m2 after transplantation in Recipient 1 and from 55 to 109 ml per minute per 1.73 m2 in Recipient 2. In both recipients, the creatinine level, which had been at a steady state, decreased after implantation of the xenograft, from 1.97 to 0.82 mg per deciliter in Recipient 1 and from 1.10 to 0.57 mg per deciliter in Recipient 2. The transplanted kidneys remained pink and well-perfused, continuing to make urine throughout the study. Biopsies that were performed at 6, 24, 48, and 54 hours revealed no signs of hyperacute or antibody-mediated rejection. Hourly urine output with the xenograft was more than double the output with the native kidneys.Genetically modified kidney xenografts from pigs remained viable and functioning in brain-dead human recipients for 54 hours, without signs of hyperacute rejection. (Funded by Lung Biotechnology.).

The loss of the tail is one of the main anatomical evolutionary changes to have occurred along the lineage leading to humans and to the “anthropomorphous apes” 1,2 . This morphological reprogramming in the ancestral hominoids has been long considered to have accommodated a characteristic style of locomotion and contributed to the evolution of bipedalism in humans 3–5 . Yet, the precise genetic mechanism that facilitated tail-loss evolution in hominoids remains unknown. Primate genome sequencing projects have made possible the identification of causal links between genotypic and phenotypic changes 6–8 , and enable the search for hominoid-specific genetic elements controlling tail development 9 . Here, we present evidence that tail-loss evolution was mediated by the insertion of an individual Alu element into the genome of the hominoid ancestor. We demonstrate that this Alu element – inserted into an intron of the TBXT gene (also called T or Brachyury 10–12 ) – pairs with a neighboring ancestral Alu element encoded in the reverse genomic orientation and leads to a hominoid-specific alternative splicing event. To study the effect of this splicing event, we generated a mouse model that mimics the expression of human TBXT products by expressing both full-length and exon-skipped isoforms of the mouse TBXT ortholog. We found that mice with this genotype exhibit the complete absence of a tail or a shortened tail, supporting the notion that the exon-skipped transcript is sufficient to induce a tail-loss phenotype, albeit with incomplete penetrance. We further noted that mice homozygous for the exon-skipped isoforms exhibited embryonic spinal cord malformations, resembling a neural tube defect condition, which affects ∼1/1000 human neonates 13 . We propose that selection for the loss of the tail along the hominoid lineage was associated with an adaptive cost of potential neural tube defects and that this ancient evolutionary trade-off may thus continue to affect human health today.

Abstract Super-enhancers (SEs) are a class of compound regulatory elements which control expression of key cell-identity genes. It remains unclear whether they are simply clusters of independent classical enhancers or whether SEs manifest emergent properties and should therefore be considered as a distinct class of element. Here, using synthetic biology and genome editing, we engineered the well characterised erythroid α-globin SE at the endogenous α-globin locus, removing all SE constituent elements in a mouse embryonic stem cell-line, to create a “blank canvas”. This has allowed us to re-build the SE through individual and combinatorial reinsertion of its five elements (R1, R2, R3, Rm, R4), to test the importance of each constituent’s sequence and position within the locus. Each re-inserted element independently creates a region of open chromatin and binds its normal repertoire of transcription factors; however, we found a high degree of functional interdependence between the five constituents. Surprisingly, the two strongest α-globin enhancers (R1 and R2) act sub-optimally both on their own and in combination, and although the other three elements (R3, Rm and R4) exhibit no discernible enhancer activity, they each exert a major positive effect in facilitating the activity of the classical enhancers (R1 and R2). This effect depends not simply on the sequence of each element but on their positions within the cluster. We propose that these “facilitators” are a novel form of regulatory element, important for ensuring the full activity of SEs, but distinct from conventional enhancer elements.

Abstract The Sc2.0 project is building a eukaryotic synthetic genome from scratch, incorporating thousands of designer features. A major milestone has been achieved with the assembly of all individual Sc2.0 chromosomes. Here, we describe the consolidation of multiple synthetic chromosomes using endoreduplication intercross to generate a strain with 6.5 synthetic chromosomes. Genome-wide chromosome conformation capture and long-read direct RNA sequencing were performed on this strain to evaluate the effects of designer modifications, such as loxPsym site insertion, tRNA relocation, and intron deletion, on 3D chromosome organization and transcript isoform profiles. To precisely map “bugs”, we developed a method, CRISPR Directed Biallelic URA3 -assisted Genome Scan, or “CRISPR D-BUGS”, exploiting directed mitotic recombination in heterozygous diploids. Using this method, we first fine-mapped a synII defect resulting from two loxPsym sites in the 3’ UTR of SHM1 . This approach was also used to map a combinatorial bug associated with synIII and synX , revealing a highly unexpected genetic interaction that links transcriptional regulation, inositol metabolism and tRNA Ser CGA abundance. “Starvation” for tRNA Ser CGA leads to insufficient levels of the key positive inositol biosynthesis regulator, Swi3 , which contains tandem UCG codons. Finally, to expedite consolidation, we employed a new method, chromosome swapping, to incorporate the largest chromosome ( synIV ), thereby consolidating more than half of the Sc2.0 genome in a single strain.

Abstract LINE-1 (L1) is the only autonomously active retrotransposon in the human genome, and accounts for 17% of the human genome. The L1 mRNA encodes two proteins, ORF1p and ORF2p. ORF1p is a homotrimeric RNA-binding protein that plays a critical role in assembling functional L1 ribonucleoprotein (RNP) complexes. Here we show that condensation of ORF1p is required for L1 retrotransposition. Using a combination of biochemical reconstitution and live-cell imaging, we demonstrate that RNA binding, electrostatic interactions, and trimer conformational dynamics together tune the properties of ORF1p assemblies to allow for efficient L1 condensate formation in cells. Furthermore, we directly relate the dynamics of ORF1p assembly to the ability to complete the entire retrotransposon life-cycle. Mutations that prevented ORF1 condensation led to loss of retrotransposition activity, while orthogonal restoration of coiled-coil conformational flexibility rescued both condensation and retrotransposition. Based on these observations, we propose that ORF1p oligomerization on L1 RNA drives the formation of a dynamic L1 condensate that is essential for retrotransposition.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) help us to understand human pathologies and develop new therapies, yet faithfully recapitulating human diseases in mice is challenging. Advances in genomics have highlighted the importance of non-coding regulatory genome sequences, which control spatiotemporal gene expression patterns and splicing in many human diseases1,2. Including regulatory extensive genomic regions, which requires large-scale genome engineering, should enhance the quality of disease modelling. Existing methods set limits on the size and efficiency of DNA delivery, hampering the routine creation of highly informative models that we call genomically rewritten and tailored GEMMs (GREAT-GEMMs). Here we describe 'mammalian switching antibiotic resistance markers progressively for integration' (mSwAP-In), a method for efficient genome rewriting in mouse embryonic stem cells. We demonstrate the use of mSwAP-In for iterative genome rewriting of up to 115 kb of a tailored Trp53 locus, as well as for humanization of mice using 116 kb and 180 kb human ACE2 loci. The ACE2 model recapitulated human ACE2 expression patterns and splicing, and notably, presented milder symptoms when challenged with SARS-CoV-2 compared with the existing K18-hACE2 model, thus representing a more human-like model of infection. Finally, we demonstrated serial genome writing by humanizing mouse Tmprss2 biallelically in the ACE2 GREAT-GEMM, highlighting the versatility of mSwAP-In in genome writing.

Abstract The retrotransposon Long Interspersed Element 1 (L1) contains adenosine rich ORFs, a characteristic that limits its expression in mammalian cells. A previously developed synthetic mouse L1 (smL1) with ORF adenosine content decreased from 40% to 26% showed higher mRNA expression levels and retrotransposed far more efficiently than the native parental element, L1spa. Here, we observe two nonsynonymous substitutions between the L1spa and smL1 ORF1 sequences, and note that the smL1 3’UTR lacks a conserved guanosine-rich region (GRR). We find that the combined effect of these amino acid changes and the 3’UTR deletion, rather than synthetic ORF sequences, accounts for the dramatic and reproducible increase in smL1 retrotransposition efficiency over L1spa. Furthermore, we demonstrate that the position of the GRR within the L1 reporter construct impacts retrotransposition efficiency. Our results prompt a reevaluation of synthetic L1 activity and suggest that native mouse L1 mobility is frequently underestimated in engineered retrotransposition assays.

Abstract Precise Hox gene expression is crucial for embryonic patterning. Intra- Hox transcription factor binding and distal enhancer elements have emerged as the major regulatory modes controlling Hox gene expression. However, quantifying their relative contributions has remained elusive. Here, we introduce ‘synthetic regulatory reconstitution’, a novel conceptual framework for studying gene regulation and apply it to the HoxA cluster. We synthesized and delivered variant rat HoxA clusters (130-170 kilobases each) to an ectopic location in the mouse genome. We find that a HoxA cluster lacking distal enhancers recapitulates correct patterns of chromatin remodeling and transcription in response to patterning signals, while distal enhancers are required for full transcriptional output. Synthetic regulatory reconstitution is a generalizable strategy to decipher the regulatory logic of gene expression in complex genomes. One-Sentence Summary Reconstitution of gene regulation using large DNA constructs unravels the regulatory logic of a developmental gene locus.

Abstract Genetically Engineered Mouse Models (GEMMs) aid in understanding human pathologies and developing new therapeutics, yet recapitulating human diseases authentically in mice is challenging to design and execute. Advances in genomics have highlighted the importance of non-coding regulatory genome sequences controlling spatiotemporal gene expression patterns and splicing to human diseases. It is thus apparent that including regulatory genomic regions during the engineering of GEMMs is highly preferable for disease modeling, with the prerequisite of large-scale genome engineering ability. Existing genome engineering methods have limits on the size and efficiency of DNA delivery, hampering routine creation of highly informative GEMMs. Here, we describe mSwAP-In ( m ammalian Sw itching A ntibiotic resistance markers P rogressively for In tegration), a method for efficient genome rewriting in mouse embryonic stem cells. We first demonstrated the use of mSwAP-In for iterative genome rewriting of up to 115 kb of the Trp53 locus, as well as for genomic humanization of up to 180 kb ACE2 locus in response to the COVID-19 pandemic. Second, we showed the hACE2 GEMM authentically recapitulated human ACE2 expression patterns and splicing, and importantly, presented milder symptoms without mortality when challenged with SARS-CoV-2 compared to the K18-ACE2 model, thus representing a more authentic model of infection.

ABSTRACT Retrotransposons are genomic DNA sequences that are capable of copying themselves to new genomic locations via RNA intermediates; LINE-1 is the only retrotransposon that remains autonomous and active in the human genome. The mobility of LINE-1 is largely repressed in somatic tissues, but LINE-1 is active in many cancers. Recent studies using LINE-1 constructs indicate that host cells activate a DNA damage response (DDR) to repair retrotransposition intermediates and resolve conflicts between LINE-1 and DNA replication. Using multi-omic data from the CPTAC project, we found correlations between LINE-1 expression and ATM-MRN-SMC DDR signalling in endometrial cancer and between LINE-1 and the ATR-CHEK1 pathway in p53 wild type breast cancer. This provides evidence that conflicts between LINE-1 and DNA replication occur in at least some human cancers. Furthermore, LINE-1 expression in these cancers is correlated with the total amount of copy number variation genome wide, indicating that, when active in cancer, pointing to a direct impact of LINE-1 associated DNA damage on genome structure. We also find that, in endometrial and ovarian cancer, LINE-1 expression is correlated with the expression of genes that drive cycle progression including E2F3, PLK1 and Aurora kinase B. This study provides evidence, supporting recent work in model cell lines, of a LINE-1/DDR connection in human tumors and raises the possibility of additional interactions between LINE-1 and the cell cycle.