Abstract Integrons are mobile genetic elements that contain multiple cassettes encoding accessory genes whose order is shuffled by a specific integrase. Integrons within mobile genetic elements often contain multiple antibiotic resistance genes that they spread among nosocomial pathogens and contribute to the current antibiotic resistance crisis. However, most integrons are presumably sedentary and encode a much broader diversity of functions. IntegronFinder is a widely used software to identify novel integrons in bacterial genomes, but has aged and lacks some useful functionalities to handle very large datasets of draft genomes or metagenomes. Here, we present IntegronFinder version 2. We have updated the code, improved its efficiency and usability, adapted the output to incomplete genome data, and added a few novel functions. We describe these changes and illustrate the relevance of the program by analyzing the distribution of integrons across more than 20,000 fully sequenced genomes. We also take full advantage of its novel capabilities to analyze close to 4 thousand Klebsiella pneumoniae genomes for the presence of integrons and antibiotic resistance genes within them. Our data shows that K. pneumoniae has a large diversity of integrons and the largest mobile integron in our database of plasmids. The pangenome of these integrons contains a total of 165 different gene families with most of the largest families being related with resistance to numerous types of antibiotics. IntegronFinder is a free and open-source software available at https://github.com/gem-pasteur/Integron_Finder .

Complex cellular functions are usually encoded by a set of genes in one or a few organized genetic loci in microbial genomes. Macromolecular System Finder (MacSyFinder) is a program that uses these properties to model and then annotate cellular functions in microbial genomes. This is done by integrating the identification of each individual gene at the level of the molecular system. We hereby present a major release of MacSyFinder (version 2) coded in Python 3. The code was improved and rationalized to facilitate future maintainability. Several new features were added to allow more flexible modelling of the systems. We introduce a more intuitive and comprehensive search engine to identify all the best candidate systems and sub-optimal ones that respect the models' constraints. We also introduce the novel macsydata companion tool that enables the easy installation and broad distribution of the models developed for MacSyFinder (macsy-models) from GitHub repositories. Finally, we have updated and improved MacSyFinder popular models: TXSScan to identify protein secretion systems, TFFscan to identify type IV filaments, CONJscan to identify conjugative systems, and CasFinder to identify CRISPR associated proteins. MacSyFinder and the updated models are available at: https://github.com/gem-pasteur/macsyfinder and https://github.com/macsy-models.

Abstract Escherichia coli is a commensal of birds and mammals, including humans. It can act as an opportunistic pathogen and is also found in water and sediments. Since most population studies have focused on clinical isolates, we studied the phylogeny, genetic diversification, and habitat-association of 1,294 isolates representative of the phylogenetic diversity of more than 5,000, mostly non-clinical, isolates originating from humans, poultry, wild animals and water sampled from the Australian continent. These strains represent the species diversity and show large variations in gene repertoires within sequence types. Recent gene transfer is driven by mobile elements and determined by habitat sharing and by phylogroup membership, suggesting that gene flow reinforces the association of certain genetic backgrounds with specific habitats. The phylogroups with smallest genomes had the highest rates of gene repertoire diversification and fewer but more diverse mobile genetic elements, suggesting that smaller genomes are associated with higher, not lower, turnover of genetic information. Many of these small genomes were in freshwater isolates suggesting that some lineages are specifically adapted to this environment. Altogether, these data contribute to explain why epidemiological clones tend to emerge from specific phylogenetic groups in the presence of pervasive horizontal gene transfer across the species.

Abstract Antibiotic resistance is rapidly spreading by horizontal transfer of resistance genes in mobile genetic elements. While plasmids are key drivers of this process, very few integrative phages encode antibiotic resistance genes. Here, we find that phage-plasmids, elements that are both phages and plasmids, often carry antibiotic resistance genes. We found 60 phage-plasmids with 184 antibiotic resistance genes, including broad-spectrum-cephalosporins, carbapenems, aminoglycosides, fluoroquinolones and colistin. These genes are in a few hotspots, seem to have been co-translocated with transposable elements, and are often in class I integrons, which had not been previously found in phages. We tried to induce six phage-plasmids with resistance genes (including four with resistance integrons) and succeeded in five cases. Other phage-plasmids and integrative prophages were co-induced in these experiments. As a proof of principle, we focused on a P1-like element encoding an extended spectrum β-lactamase, bla CTX-M-55 . After induction, we confirmed that it’s capable to infect and convert four other E. coli strains. Its re-induction led to further conversion of a sensitive strain, confirming it’s a fully functional phage. This study shows that phage-plasmids carry a large diversity of clinically relevant antibiotic resistance genes that they transfer across bacteria. As plasmids, these elements seem very plastic and capable of acquiring genes from other plasmids. As phages, they may provide novel paths of transfer for resistance genes, because they can infect bacteria distant in time and space from the original host. As a matter of alarm, they may also eventually mediate transfer to other types of phages. Importance Dissemination of antimicrobial resistances is a major threat to global health. Here, we show that a group of temperate bacterial viruses (=phages), termed phage-plasmids, commonly encode different and multiple types of resistance genes of high clinical importance, often in integrons. This is unexpected since phages typically do not carry resistance genes and, hence, do not confer their hosts with resistance upon infection and genome integration. Our experiments with phage-plasmids isolated from clinical settings confirmed they infect sensitive strains, rendering them antibiotic resistant. The spread of antibiotic resistance genes by phage-plasmids is worrisome because it dispenses cell-to-cell contact, necessary for the canonical plasmid transfer (=conjugation). Furthermore, their integrons are now genetic platforms for the acquisition of novel resistance genes.

ABSTRACT Plasmids and temperate phages are mobile genetic elements driving bacterial evolution. They are usually regarded as very distinct. However, some elements, termed phage-plasmids, are known to be both plasmids and phages, e . g . P1, N15 or SSU5. The number, distribution, relatedness and characteristics of these phage-plasmids are poorly known. Here, we screened for these elements among ca. 14000 phages and plasmids and identified 780 phage-plasmids across very diverse bacterial phyla. We grouped 92% of them by similarity of gene repertoires to define 8 families and 18 other broader communities of elements. The existence of these large groups suggests that phage-plasmids are ancient. Their gene repertoires are large, the average element is larger than an average phage or plasmid, and they include slightly more homologs to phages than to plasmids. We analyzed the pangenomes and the genetic organization of each group of phage-plasmids and found the key phage genes to be conserved and co-localized within families, whereas genes with homologs in plasmids are much more variable and include most accessory genes. Phage-plasmids are a sizeable fraction of all phages and plasmids and could have key roles in bridging the genetic divide between phages and other mobile genetic elements.

Abstract Protein secretion systems are complex molecular machineries that translocate proteins through the outer membrane and sometimes through multiple other barriers. They have evolved by co-option of components from other envelope-associated cellular machineries, making them sometimes difficult to identify and discriminate. Here, we describe how to identify protein secretion systems in bacterial genomes using the MacSyFinder program. This flexible computational tool uses the knowledge gathered from experimental studies to identify homologous systems in genome data. It can be used with a set of pre-defined MacSyFinder models—”TXSScan”, to identify all major secretion systems of diderm bacteria ( i . e ., with inner and LPS-containing outer membranes) as well as evolutionarily related cell appendages (pili and flagella). For this, it identifies and clusters co-localized genes encoding proteins of secretion systems using sequence similarity search with Hidden Markov Model (HMM) protein profiles. Finally, it checks if the clusters’ genetic content and genomic organization satisfy the constraints of the model. TXSScan models can be altered in the command line or customized to search for variants of known secretion systems. Models can also be built from scratch to identify novel systems. In this chapter, we describe a complete pipeline of analysis, starting from i) the integration of information from a reference set of experimentally studied systems, ii) the identification of conserved proteins and the construction of their HMM protein profiles, iii) the definition and optimization of “macsy-models”, and iv) their use and online distribution as tools to search genomic data for secretion systems of interest. MacSyFinder is available here: https://github.com/gem-pasteur/macsyfinder , and MacSyFinder models here: https://github.com/macsy-models .

Abstract Plasmids are key drivers of bacterial evolution by transferring genes between cells via conjugation. Yet, half of the plasmids lack all protein coding genes for this process. We searched to solve this conundrum by identifying conjugative origins of transfer over thousands of plasmids and chromosomes of Escherichia coli and Staphylococcus aureus . We found that plasmids carrying these sequences are very abundant and have the highest densities of antimicrobial resistance genes. They are hyper-parasites that directly hijack conjugative or mobilizable elements, but not both. These functional dependencies explain the co-occurrence of each type of plasmid in cells and illuminate the evolutionary relationships between the elements. We characterized systematically the genetic traits of plasmids in relation to conjugation and alternative mechanisms of transfer, and can now propose a confident putative mechanism of transfer for ca. 90% of them. The few exceptions could be passively mobilized by other processes. We conclude there is no conundrum concerning plasmid mobility.

Abstract Bacteria from the same species can differ widely in their gene content. In E. coli , the set of genes shared by all strains, known as the core genome, represents about half the number of genes present in any strain. While recent advances in bacterial genomics have enabled to unravel genes required for fitness in various experimental conditions at the genome scale, most studies have focused on model strains. As a result, the impact of this genetic diversity on core processes of the bacterial cell largely remains to be investigated. Here, we developed a new CRISPR interference platform for high-throughput gene repression that is compatible with most E. coli isolates and closely-related species. We applied it to assess the importance of ∼3,400 nearly ubiquitous genes in 3 growth media in 18 representative E. coli strains spanning most common phylogroups and lifestyles of the species. Our screens highlighted extensive variations in gene essentiality between strains and conditions. Unlike variations in gene expression level, variations in gene essentiality do not recapitulate the strains’ phylogeny. Investigation of the genetic determinants for these variations highlighted the importance of epistatic interactions with mobile genetic elements. In particular, we showed how mobile genetic elements can trigger the essentiality of core genes that are usually nonessential. This study provides new insights into the evolvability of gene essentiality and argues for the importance of studying various isolates from the same species in bacterial genomics.

ABSTRACT Bacteriophages (phages) evolve rapidly by acquiring genes from other phages leading to mosaic genomes. Here, we identify numerous genetic transfers between distantly related phages and aim at understanding their frequency, consequences and the conditions favoring them. Gene flow tends to occur between phages that are enriched for recombinases, transposases and non-homologous end joining, suggesting that both homologous and illegitimate recombination contribute to gene flow. Phage family and host phyla are strong barriers to gene exchange, but phage lifestyle is not. We observe more exchanges between temperate phages even if they tend to have smaller genomes. These acquisitions often include transcription regulators and lysins. Yet, there is also extensive gene flow between temperate and virulent phages, or between the latter. These predominantly involve virulent phages with large genomes previously classed as low gene flux, and lead to the preferential transfer of genes encoding functions involved in cell energetics, nucleotide metabolism, DNA packaging and injection, and virion assembly. Such exchanges may explain the acquisition of genes in virulent phages, which tend to have the largest genomes. We used genetic transfers, which occur upon co-infection of a host, to compare phage host range. We found that virulent phages have broader host ranges and mediate genetic exchanges between narrow host range temperate phages infecting distant bacterial hosts, thus contributing to gene flow between virulent phages, as well as between temperate phages. This gene flow drastically expands the gene repertoires available for phage and bacterial evolution, including the transfer of functional innovations across taxa.

Abstract Biological modularity enhances evolutionary adaptability by allowing rearrangement of functional components. One striking example are bacterial viruses (phages). They exhibit extensive genomic modularity by being built of independent functional modules that evolve separately and combine in various ways, making them astoundingly diverse. While multiple studies have investigated genomic modularity in phages, less attention has been given to protein modularity—proteins having distinct building blocks or domains that can evolve and recombine, enhancing functional and genetic diversity. To better understand the impact of protein modularity on viral evolution, we quantified it by detecting instances of domain mosaicism, defined as a homologous fragment sharing between two otherwise unrelated proteins. We used highly sensitive homology detection to quantify domain mosaicism between pairs of 133,574 representative phage proteins and to understand its relationship with functional diversity in phage genomes. We found that diverse functional classes often shared homologous domains. This phenomenon was often linked to protein modularity, particularly in receptor-binding proteins, endolysins and DNA polymerases. We also identified multiple instances of recent diversification via exchange and gain/loss of domains in receptor-binding proteins, neck passage structures, endolysins and some members of the core replication machinery. Diversification via protein fragment exchange often transcended distant taxonomic and ecological borders. We argue that the ongoing diversification via shuffling of protein domains associated with those functions is reflective of co-evolutionary arms race and the resulting diversifying selection to overcome multiple mechanisms of bacterial resistance against phages.