Abstract Palatine tonsils are secondary lymphoid organs representing the first line of immunological defense against inhaled or ingested pathogens. Here, we present a comprehensive census of cell types forming the human tonsil by applying single-cell transcriptome, epigenome, proteome and adaptive immune repertoire sequencing as well as spatial transcriptomics, resulting in an atlas of >357,000 cells. We provide a glossary of 121 annotated cell types and states, and disentangle gene regulatory mechanisms that drive cells through specialized lineage trajectories. Exemplarily, we stratify multiple tonsil-resident myeloid slancyte subtypes, establish a distant BCL6 superenhancer as locally active in both follicle-associated T and B cells, and describe SIX5 as a potentially novel transcriptional regulator of plasma cell maturation. Further, our atlas is a reference map to understand alterations observed in disease. Here, we discover immune-phenotype plasticity in tumoral cells and microenvironment shifts of mantle cell lymphomas (MCL). To facilitate such reference-based analysis, we develop HCATonsilData and SLOcatoR, a computational framework that provides programmatic and modular access to our dataset; and allows the straightforward annotation of future single-cell profiles from secondary lymphoid organs.

Neonatal and infant immune responses are characterized by a limited capability to generate protective Ab titers and memory B cells as seen in adults. Multiple studies support an immature or even impaired character of umbilical cord blood (UCB) B cells themselves. In this study, we provide a comprehensive molecular and functional comparison of B cell subsets from UCB and adult peripheral blood. Most UCB B cells have a mature, naive B cell phenotype as seen in adults. The UCB Ig repertoire is highly variable but interindividually conserved, as BCR clonotypes are frequently shared between neonates. Furthermore, UCB B cells show a distinct transcriptional program that confers accelerated responsiveness to stimulation and facilitated IgA class switching. Stimulation drives extensive differentiation into Ab-secreting cells, presumably limiting memory B cell formation. Humanized mice suggest that the distinctness of UCB versus adult B cells is already reflected by the developmental program of hematopoietic precursors, arguing for a layered B-1/B-2 lineage system as in mice, albeit our findings suggest only partial comparability to murine B-1 cells. Our study shows that UCB B cells are not immature or impaired but differ from their adult mature counterpart in a conserved BCR repertoire, efficient IgA class switching, and accelerated, likely transient response dynamics.

Abstract The human infant B cell system is considered premature or impaired. Here we show that most cord blood B cells are mature and functional as seen in adults, albeit with distinct transcriptional programs providing accelerated responsiveness to T cell-independent and T cell-dependent stimulation and facilitated IgA class switching. Stimulation drives extensive differentiation into antibody-secreting cells, thereby presumably limiting memory B cell formation. The neonatal Ig-repertoire is highly variable, but conserved, showing recurrent B cell receptor (BCR) clonotypes frequently shared between neonates. Our study demonstrates that cord blood B cells are not impaired but differ from their adult counterpart in a conserved BCR repertoire and rapid but transient response dynamics. These properties may account for the sensitivity of neonates to infections and limited effectivity of vaccination strategies. Humanized mice suggest that the distinctness of cord blood versus adult B cells is already reflected by the developmental program of hematopoietic precursors, arguing for a layered B-1/B-2 lineage system as in mice. Still, our findings reveal overall limited comparability of human cord blood B cells and murine B-1 cells. Significance Statement Neonates and infants suffer from enhanced susceptibility to infections. Our study contrasts with the current concept of a premature or impaired B cell system in neonates, by showing that most cord blood B cells are mature and functional. However, their responses are rapid but provide only short-term protection, which may help to improve infant vaccination strategies. We propose an altered perspective on the early human B cell system, which looks similar to but functions differently from the adult counterpart. Finally, our analysis indicates that cord blood- and adult B cell development occur layered as in mice, but certain mouse models still may offer a limited view on human neonatal B cell immunity.

SUMMARY PARAGRAPH Disease-causing mutations in genes encoding transcription factors (TFs) are a recurrent finding in hematopoietic malignancies and might involve key regulators of lineage adherence and cellular differentiation 1–3 . Such mutations can affect TF-interactions with their cognate DNA-binding motifs 4, 5 . Whether and how TF-mutations impact upon the nature of binding to TF composite elements (CE) and influence their interaction with other TFs is unclear. Here, we report a new mechanism of TF alteration in human lymphomas with perturbed B cell identity. It is caused by a recurrent somatic missense mutation c.295T>C (p.Cys99Arg; p.C99R) targeting the center of the DNA-binding domain of Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4), a key TF in immune cell-differentiation and -activation 6, 7 . IRF4-C99R fundamentally alters IRF4 DNA-binding, with loss-of-binding to canonical IRF motifs and neomorphic gain-of-binding to canonical and non-canonical IRF composite elements (CEs). Furthermore, IRF4-C99R thoroughly modifies IRF4 function, by blocking IRF4-dependent plasma cell induction, and up-regulating disease-specific genes in a non-canonical Activator Protein-1 (AP-1)-IRF-CE (AICE)-dependent manner. Our data explain how a single arginine mutation creates a complex switch of TF specificity and gene regulation. These data open the possibility of designing specific inhibitors to block the neomorphic, disease-causing DNA-binding activities of a mutant transcription factor.