The major structural components of HIV are synthesized as a 55-kDa polyprotein, Gag. Particle formation is driven by the self-assembly of Gag into a curved hexameric lattice, the structure of which is poorly understood. We used cryoelectron tomography and contrast-transfer-function corrected subtomogram averaging to study the structure of the assembled immature Gag lattice to ≈17-Å resolution. Gag is arranged in the immature virus as a single, continuous, but incomplete hexameric lattice whose curvature is mediated without a requirement for pentameric defects. The resolution of the structure allows positioning of individual protein domains. High-resolution crystal structures were fitted into the reconstruction to locate protein–protein interfaces involved in Gag assembly, and to identify the structural transformations associated with virus maturation. The results of this study suggest a concept for the formation of nonsymmetrical enveloped viruses of variable sizes.

We present a new approach for macromolecular structure determination from multiple particles in electron cryo-tomography (cryo-ET) data sets. Whereas existing subtomogram averaging approaches are based on 3D data models, we propose to optimise a regularised likelihood target that approximates a function of the 2D experimental images. In addition, analogous to Bayesian polishing and contrast transfer function (CTF) refinement in single-particle analysis, we describe the approaches that exploit the increased signal-to-noise ratio in the averaged structure to optimise tilt-series alignments, beam-induced motions of the particles throughout the tilt-series acquisition, defoci of the individual particles, as well as higher-order optical aberrations of the microscope. Implementation of our approaches in the open-source software package RELION aims to facilitate their general use, particularly for those researchers who are already familiar with its single-particle analysis tools. We illustrate for three applications that our approaches allow structure determination from cryo-ET data to resolutions sufficient for de novo atomic modelling.

Abstract We present a new approach for macromolecular structure determination from multiple particles in electron cryo-tomography (cryo-ET) data sets. Whereas existing subtomogram averaging approaches are based on 3D data models, we propose to optimise a regularised likelihood target that approximates a function of the 2D experimental images. In addition, analogous to Bayesian polishing and contrast transfer function (CTF) refinement in single-particle analysis, we describe approaches that exploit the increased signal-to-noise ratio in the averaged structure to optimise tilt series alignments, beam-induced motions of the particles throughout the tilt series acquisition, defoci of the individual particles, as well as higher-order optical aberrations of the microscope. Implementation of our approaches in the open-source software package RELION aims to facilitate their general use, in particular for those researchers who are already familiar with its single-particle analysis tools. We illustrate for three applications that our approaches allow structure determination from cryo-ET data to resolutions sufficient for de novo atomic modelling.

Abstract Human respiratory syncytial virus (RSV) causes severe respiratory illness in children and the elderly. Treatments for RSV disease are however limited and efforts to produce an effective vaccine have so far been unsuccessful. Understanding RSV virion structure is an important prerequisite for developing interventions to treat or prevent infection but has been challenging because of the fragility of virions propagated in cell culture. Here we show, using cryogenic electron microscopy (cryoEM) and cryogenic electron tomography (cryoET) of RSV particles cultivated directly on transmission electron microscopy (TEM) grids, that there is extensive helical symmetry in RSV filamentous virions. We have calculated a 16 Å resolution three-dimensional reconstruction of the viral envelope, targeting the matrix protein (M) that forms an endoskeleton below the viral membrane. These data define a helical lattice of M proteins, showing how M is oriented relative to the viral envelope and that helical ordering of viral glycoproteins that stud the viral envelope is coordinated by the M layer. Moreover, the helically ordered viral glycoproteins in RSV filamentous virions cluster in pairs, which may have implications for the conformation of fusion (F) glycoprotein epitopes that are the principal target for vaccine and monoclonal antibody development. We also report the presence, in authentic virus infections, of N-RNA rings packaged within RSV filamentous virions. Overall, the structural data obtained provides molecular insight into the organization of the virion and the mechanism of its assembly.

Abstract Protein secretion is initiated at the endoplasmic reticulum by the COPII coat, which self-assembles to form vesicles. Here, we examine the mechanisms by which the outer scaffolding layer of the coat drives local assembly of a structure rigid enough to enforce membrane curvature, yet able to readily disassemble at the Golgi. An intrinsically disordered region in the outer coat protein, Sec31, drives binding with an inner coat layer via multiple distinct interfaces. Interactions are individually dispensable but combinatorially reinforce each other, suggesting coat oligomerization is driven by the cumulative effects of multivalent interactions. Such a multimodal assembly platform could be readily reversed at the Golgi via perturbation of each individual interface. These design principles provide an explanation for how cells build a powerful yet transient scaffold to direct vesicle traffic.

Abstract The COPII coat mediates Endoplasmic Reticulum (ER) to Golgi trafficking for thousands of proteins. Five essential coat proteins assemble at the ER into a characteristic two-layer architecture, which recruits cargo proteins whilst sculpting membrane carriers with diverse morphologies. How coat architecture drives membrane curvature whilst ensuring morphological plasticity is largely unknown, yet is central to understanding mechanisms of carrier formation. Here, we use an established reconstitution system to visualise the complete, membrane-assembled COPII coat with unprecedented detail by cryo-electron tomography and subtomogram averaging. We discover a network of interactions within and between coat layers, including multiple interfaces that were previously unknown. We reveal the physiological importance of these interactions using genetic and biochemical approaches. A newly resolved Sec31 C-terminal domain provides order to the coat and is essential to drive membrane curvature in cells. Moreover, a novel outer coat assembly mode provides a basis for coat adaptability to varying membrane curvatures. Furthermore, a newly resolved region of Sec23, which we term the L-loop, imparts coat stability and in part dictates membrane shape. Our results suggest these interactions collectively contribute to coat organisation and membrane curvature, providing a structural framework to understand regulatory mechanisms of COPII trafficking and secretion.

Abstract Proteins traverse the eukaryotic secretory pathway via membrane trafficking between organelles. The COPII coat mediates the anterograde transport of newly synthesised proteins from the endoplasmic reticulum, engaging cargoes with wide ranges of sizes and biophysical properties. The native architecture of the COPII coat and the cargo-dependent regulation of its assembly remain poorly understood. Here, we have reconstituted COPII-coated membrane carriers using purified S. cerevisiae proteins and cell-derived microsomes as a native membrane source. Using cryo-electron tomography with subtomogram averaging, we demonstrate that the COPII coat binds cargo and forms largely spherical vesicles from native membranes. We reveal the architecture of the inner and outer coat layers and shed light on how spherical carriers are formed. Our results provide novel insights into the architecture and regulation of the COPII coat and challenge our current understanding of how membrane curvature is generated.