Like all higher organisms, plants have evolved in the context of a microbial world, shaping both their evolution and their contemporary ecology. Interactions between plant roots and soil microorganisms are critical for plant fitness in natural environments. Given this co-evolution and the pivotal importance of plant-microbial interactions, it has been hypothesized, and a growing body of literature suggests, that plants may regulate the composition of their rhizosphere to promote the growth of microorganisms that improve plant fitness in a given ecosystem. Here, using a combination of comparative genomics and exometabolomics, we show that pre-programmed developmental processes in plants (Avena barbata) result in consistent patterns in the chemical composition of root exudates. This chemical succession in the rhizosphere interacts with microbial metabolite substrate preferences that are predictable from genome sequences. Specifically, we observed a preference by rhizosphere bacteria for consumption of aromatic organic acids exuded by plants (nicotinic, shikimic, salicylic, cinnamic and indole-3-acetic). The combination of these plant exudation traits and microbial substrate uptake traits interact to yield the patterns of microbial community assembly observed in the rhizosphere of an annual grass. This discovery provides a mechanistic underpinning for the process of rhizosphere microbial community assembly and provides an attractive direction for the manipulation of the rhizosphere microbiome for beneficial outcomes.

Article21 June 2018Open Access Transparent process Deciphering microbial interactions in synthetic human gut microbiome communities Ophelia S Venturelli Corresponding Author Ophelia S Venturelli [email protected] orcid.org/0000-0003-2200-1963 Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Alex V Carr Alex V Carr Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Garth Fisher Garth Fisher Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Ryan H Hsu Ryan H Hsu orcid.org/0000-0001-8221-224X California Institute for Quantitative Biosciences, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Rebecca Lau Rebecca Lau Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Benjamin P Bowen Benjamin P Bowen Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Susan Hromada Susan Hromada Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Trent Northen Trent Northen Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Adam P Arkin Adam P Arkin Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA California Institute for Quantitative Biosciences, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Department of Bioengineering, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Energy Biosciences Institute, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Ophelia S Venturelli Corresponding Author Ophelia S Venturelli [email protected] orcid.org/0000-0003-2200-1963 Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Alex V Carr Alex V Carr Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Garth Fisher Garth Fisher Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Ryan H Hsu Ryan H Hsu orcid.org/0000-0001-8221-224X California Institute for Quantitative Biosciences, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Rebecca Lau Rebecca Lau Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Benjamin P Bowen Benjamin P Bowen Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Susan Hromada Susan Hromada Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA Search for more papers by this author Trent Northen Trent Northen Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Adam P Arkin Adam P Arkin Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA California Institute for Quantitative Biosciences, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Department of Bioengineering, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Energy Biosciences Institute, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA Search for more papers by this author Author Information Ophelia S Venturelli *,1, Alex V Carr2,‡,‡, Garth Fisher2,‡, Ryan H Hsu3, Rebecca Lau2, Benjamin P Bowen2, Susan Hromada1, Trent Northen2 and Adam P Arkin2,3,4,5 1Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA 2Environmental Genomics and Systems Biology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA 3California Institute for Quantitative Biosciences, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA 4Department of Bioengineering, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA 5Energy Biosciences Institute, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USA ‡These authors contributed equally to this work ‡Correction added on 27 June 2018 after first online publication: Alex C Carr was corrected to Alex V Carr *Corresponding author. Tel: +1 608 263 7017; E-mail: [email protected] Molecular Systems Biology (2018)14:e8157https://doi.org/10.15252/msb.20178157 See also: C Abreu et al (June 2018) PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract The ecological forces that govern the assembly and stability of the human gut microbiota remain unresolved. We developed a generalizable model-guided framework to predict higher-dimensional consortia from time-resolved measurements of lower-order assemblages. This method was employed to decipher microbial interactions in a diverse human gut microbiome synthetic community. We show that pairwise interactions are major drivers of multi-species community dynamics, as opposed to higher-order interactions. The inferred ecological network exhibits a high proportion of negative and frequent positive interactions. Ecological drivers and responsive recipient species were discovered in the network. Our model demonstrated that a prevalent positive and negative interaction topology enables robust coexistence by implementing a negative feedback loop that balances disparities in monospecies fitness levels. We show that negative interactions could generate history-dependent responses of initial species proportions that frequently do not originate from bistability. Measurements of extracellular metabolites illuminated the metabolic capabilities of monospecies and potential molecular basis of microbial interactions. In sum, these methods defined the ecological roles of major human-associated intestinal species and illuminated design principles of microbial communities. Synopsis Analysis of microbial interactions in a synthetic human gut microbiome community shows that pairwise microbial interactions are major drivers of multi-species community dynamics. The study reveals ecological drivers, metabolite hub species and ecologically sensitive organisms in the network. A data-driven pipeline is used to construct a predictive dynamic model of a diverse anaerobic human gut microbiome community. Design principles of stable coexistence and history-dependence are elucidated. Ecological roles and metabolite profiles are analyzed for each organism. The study highlights challenges in using phylogenetic and exo-metabolomic “signals” to predict microbial interactions and community functions. Introduction Microbes have evolved in diverse microbial communities that occupy nearly every environment on Earth, spanning extreme environments such as acid mine drains and hot springs to multicellular organisms. The gut microbiome is a dense collection of microorganisms that inhabits the human gastrointestinal tract (Lozupone et al, 2012; Earle et al, 2015; Tropini et al, 2017) and performs numerous functions to impact human physiology, nutrition, behavior, and development (Ley et al, 2005; Fischbach & Sonnenburg, 2011; Foster & McVey Neufeld, 2013; Louis et al, 2014; Sharon et al, 2014; Rooks & Garrett, 2016). Functions of the gut microbiota are partitioned among genetically distinct populations that interact to perform complex chemical transformations and exhibit emergent properties such as colonization resistance at the community level. Such collective functions are realized by the combined interactions of diverse microbial species operating on multiple time and spatial scales and could not be achieved by a single monospecies population. The degree of spatial structuring in the gut microbiota varies across length scales: At a macroscale of hundreds of micrometers, bacteria cluster into distinct habitats, whereas at a scale of micrometers, intermixing of community members has been observed (Donaldson et al, 2015; Earle et al, 2015; Mark Welch et al, 2017). The gut microbiota is composed of hundreds of bacterial species, the majority of which span the Firmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria phyla (Ley et al, 2006). Constituent strains of the gut microbiota have been shown to persist in an individual over long periods of time, demonstrating that the gut microbiota exhibits stability over time (Faith et al, 2013). Perturbations to the system such as dietary shifts or antibiotic administration can shift the operating point of the gut microbiota to an alternative state (Relman, 2012). While the identities of the organisms and microbial co-occurrence relationships across individuals have been elucidated (Faust et al, 2012), we lack a quantitative understanding of how microbial interactions shape community assembly, stability, and response to perturbations. For example, the ecological and molecular forces that enable stable coexistence of the dominant phyla Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria are not well understood (Fischbach & Sonnenburg, 2011). The resilience of microbiomes, defined as the capacity to recover from perturbations, is strongly linked to microbial diversity. Indeed, a reduction in microbial diversity of the human gut microbiome is associated with multiple diseases, suggesting that a high-dimensional and functionally heterogeneous ecosystem promotes human health (Sommer et al, 2017). Understanding the molecular and ecological factors influencing the stability and resilience of the gut microbiota has implications for the development of targeted interventions to modulate microbiome states. Central to this problem is inferring unknown microbial interactions and developing tools to predict temporal changes in community behaviors in response to environmental stimuli. Cooperation and competition generate positive and negative feedbacks in microbial communities and influence functional activities and stability. Negative interactions have been shown to dominate microbial inter-relationships in synthetic aquatic microcosms (Foster & Bell, 2012). However, the prevalence of competition and cooperation in microbial communities occupying other diverse environments such as the human gut microbiota remains elusive. Direct negative interactions in microbial consortia can originate from competition for resources or space, biomolecular warfare, or production of toxic waste products (Hibbing et al, 2010). Positive interactions can stem from secreted metabolites that are utilized by a community member or detoxification of the environment. Pairwise microbial interactions can be modified by a third organism, leading to higher-order effects that influence community behaviors (Bairey et al, 2016). Ecological driver species, which exhibit a large impact on community structure and function, represent key nodes in the network that could be manipulated to control community states (Gibson et al, 2016). Predicting community dynamics is a key step toward understanding the organizational principles of microbial communities. Computational models at different resolutions can be used to analyze and predict the behaviors of microbial communities (Faust & Raes, 2012). Dynamic computational models can be used to investigate temporal changes in community structure, and tools from dynamical systems theory can be used to analyze system properties including stability and parameter sensitivity (Astrom & Murray, 2010). Generalized Lotka–Volterra (gLV) is an ordinary differential equation model that represents microbial communities with a limited number of parameters that can be deduced from time-series data. Here, we develop a systematic modeling and experimental pipeline to construct a predictive computational model of microbial community dynamics and interrogate microbial interactions mediating community assembly. Time-resolved measurements of monospecies and pairwise assemblages were used to train a dynamic computational model of a diverse synthetic human gut microbiome community. Our model revealed a high proportion of negative and frequent positive interactions. Specific ecological driver species and responsive organisms to community context were identified in the network. Bacteroidetes exhibited an overall negative impact on the community, whereas specific members of Actinobacteria and Firmicutes displayed numerous positive outgoing interactions. A prevalent pairwise sub-network composed of positive and negative interactions exhibited robust species coexistence to variations in model parameters. Our model showed that the majority of history-dependent responses in pairwise consortia were due to slow convergence to a steady state composition and these networks were enriched for negative interactions. The metabolic capabilities of monospecies were elucidated using exo-metabolomics profiling, and these data pinpointed a set of metabolites predicted to mediate positive and negative interactions. However, the metabolite profiles failed to forecast specific influential organisms modulating community assembly. Together, these results show that combinations of pairwise interactions can represent the assembly of multi-species communities and such pairwise couplings can realize a diverse repertoire of dynamic behaviors. Results Probing the temporal behaviors of monospecies and pairwise assemblages We aimed to dissect the microbial interactions influencing community assembly in a reduced complexity model gut community spanning the major phyla Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, and Proteobacteria. To this end, a synthetic ecology encompassing prevalent human-associated intestinal species Bacteroides thetaiotaomicron (BT), Bacteroides ovatus (BO), Bacteroides uniformis (BU), Bacteroides vulgatus (BV), Blautia hydrogenotrophica (BH), Collinsella aerofaciens (CA), Clostridium hiranonis (CH), Desulfovibrio piger (DP), Eggerthella lenta (EL), Eubacterium rectale (ER), Faecalibacterium prausnitzii (FP), and Prevotella copri (PC) was designed to mirror the functional and phylogenetic diversity of the natural system (Fig 1A; Qin et al, 2010). These species have been shown to contribute significantly to human health and are implicated in multiple human diseases (Watterlot et al, 2008; Larsen et al, 2010; Thota et al, 2011; Fujimoto et al, 2013; Haiser et al, 2013; Scher et al, 2013; Table 1). Figure 1. Experimental design for high-throughput characterization of synthetic human gut microbiome consortia Phylogenetic tree of the 12-member synthetic ecology spanning the major phyla in the gut microbiome including Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Proteobacteria. Phylogenetic analysis was performed using a concatenated alignment of single-copy marker genes obtained via PhyloSift (preprint: Darling et al, 2014). Maximum likelihood trees were generated using default options. The scale bar represents the number of substitutions per site in the alignment. Schematic of the experimental design for this study. Species were combined using an approximately 1:1 or 19:1 initial proportion based on absorbance measurements at 600 nm (OD600) into microtiter plates using liquid-handling robotic manipulation. Approximately every 12 h, samples were collected for multiplexed 16S rRNA gene sequencing (black circles). Relative abundance was measured using multiplexed 16S rRNA gene sequencing of the V3–V4 region using dual-indexed primers compatible with an Illumina platform (stacked bar plot, bottom right). Serial transfers were performed in approximately 24 intervals (purple bars, top) by transferring an aliquot of the communities into fresh media using a 1:20 dilution. In parallel, time-resolved OD600 measurements of monospecies and consortia were performed. Download figure Download PowerPoint Table 1. Table of species used in study and associations with human diseases based on previous literature. Arrows pointing up or down denote positive or negative associations, respectively Species Association(s) Prevotella copri (PC) Inflammatory and autoimmune disease (↑) (Scher et al, 2013), autism (↓) (Kang et al, 2013) Bacteroides vulgatus (BV) Ulcerative colitis (↑) (Bamba et al, 1995) Bacteroides uniformis (BU) Metabolic/immunological dysfunction (↓) (Gauffin Cano et al, 2012) Bacteroides ovatus (BO) Type I diabetes (↑) (Giongo et al, 2011) Bacteroides thetaiotaomicron (BT) Ulcerative colitis (↑)(Bloom et al, 2011) Faecalibacterium prausnitzii (FP) Crohn's disease (↓) (Watterlot et al, 2008), inflammatory bowel disease (↓) (Segain et al, 2000), Celiac disease (↓) (De Palma et al, 2010) Blautia hydrogenotrophica (BH) Healthy human colon (↑) (Nava et al, 2012) Eubacterium rectale (ER) Type II diabetes (↑) (Larsen et al, 2010) Collinsella aerofaciens (CA) Colon cancer (↓) (Moore & Moore, 1995), rheumatoid arthritis (↑) (Chen et al, 2016) Eggerthella lenta (EL) Cardiac drug transformations (↑) (Haiser et al, 2013), Crohn's disease (↑) (Thota et al, 2011), rheumatoid arthritis (↑) (Chen et al, 2016) Desulfovibrio piger (DP) Regressive autism (↑) (Finegold et al, 2012) Clostridium hiranonis (CH) None reported Synthetic assemblages were arrayed in microtiter plates in an anaerobic chamber using an automated liquid-handling procedure (see Materials and Methods). A rich media (see Materials and Methods) was selected to support the growth of all monospecies. The communities were serially transferred at 24-h intervals to prevent strains with long lag phases from being eliminated and allow communities to approach a steady state composition by monitoring assembly over many cell generations. Further, serial transfers can also reflect recurrent temporal perturbations to the gut microbiota such as diet and colonic transit time (Fig 1B). Multiplexed 16S rRNA gene sequencing was performed in approximately 12-h intervals to elucidate the temporal variations in community structure at different community growth stages. The relative abundance for each species was computed as the sum of the read counts for each organism divided by the total number of reads per condition (see Materials and Methods). Since model construction is aided by absolute abundance information (Bucci et al, 2016; Widder et al, 2016), the total biomass of the communities was monitored approximately every 30 min using absorbance at 600 nm (OD600). Cellular traits such as cell adhesion, size, and shape can influence OD600 measurements (Stevenson et al, 2016). In addition, counting of colony-forming units (CFU) is biased by cell adhesion, dormant sub-populations, growth selection on solid vs. liquid media, and growth stage (Jansson & Prosser, 1997; Volkmer & Heinemann, 2011; Ou et al, 2017). Our model was trained on absolute abundance estimated from OD600 measurements and used to predict absolute abundance based on OD600 and thus automatically accounts for any potential biases. To infer microbial interactions, time-resolved measurements of all monospecies and pairwise communities (66 combinations) were performed using an approximately 1:1 initial abundance ratio based on OD600 values (PW1 dataset, Appendix Fig S1, Dataset EV1). Monospecies growth and community composition were measured using OD600 measurements of total biomass and multiplexed 16S rRNA gene sequencing, respectively (see Materials and Methods). The monospecies displayed a broad range of growth rates, carrying capacities and lag phases (M dataset, Appendix Fig S2). Pairwise consortia exhibited diverse growth responses and dynamic behaviors including coexistence and single-species dominance (Appendix Fig S1). The distribution of absolute abundance of each species across communities in PW1 provided insight into variability in growth in the presence of a second organism (Appendix Fig S3A). Absolute species abundance was normalized to the monospecies maximum OD600 value to evaluate relative changes in the baseline fitness of each organism in the presence of second species. Bacteroides and CH displayed the lowest coefficient of variation (CV), indicating that the fitness levels of these organisms were not significantly modified by a second species (Appendix Fig S3B). The remaining species displayed a bimodal (FP, DP, PC, BH, and CA), long-tail distribution (ER and EL), and/or high CV (ER, BH, CA, and PC), demonstrating that growth was significantly altered in the presence of specific organisms. To further probe the dynamic responses of pairwise consortia, a set of 15 consortia (Fig 2B, Dataset EV2) inoculated at different initial species proportions based on OD600 values (95% species A, 5% species B, and the second wherein these percentages were reversed) were characterized using our experimental workflow (PW2 dataset, Appendix Fig S4). The community behaviors were classified into the following categories based on a quantitative threshold in species proportions at 72 h: (i) single-species dominance; (ii) stable coexistence wherein both species persisted above an abundance threshold; (iii) history dependence whereby communities inoculated using distinct initial species proportions mapped to different community structures; or (iv) other for communities that did not quantitatively satisfy the relative abundance thresholds for cases 1–3. A subset of the communities classified in the other category displayed weak history-dependent responses potentially attributed to variations in biological replicates. The qualitative behaviors of the remaining 51 pairwise communities were classified based on community structure at an initial (t = 0) and final (t = 72 h) time point using the PW2 experimental design wherein the organisms were inoculated using different initial species proportions (95% species A, 5% species B, and the reciprocal percentages, Appendix Fig S5A). Together, these results demonstrated that approximately 50, 24, and 12% of pairwise communities displayed dominance, stable coexistence, and history dependence, respectively (Appendix Fig S5B). Figure 2. Model training of generalized Lotka–Volterra (gLV) to time-resolved measurements of monospecies and pairwise assemblages Species relative abundance as a function of time for all pairwise communities. Experimental measurements and model fits based on T3 are represented as data points and lines, respectively. In each subplot, time and species relative abundance are displayed on the x- and y-axis, respectively. Stars denote datasets with a sum of mean squared errors greater than 0.15. Error bars represent 1 s.d. from the mean of at least three biological replicates. Temporal changes in species relative abundance of a selected set of pairwise assemblages inoculated at 5% species A, 95% species B or 95% species A, 5% species B based on OD600 values. Time and relative abundance are represented on the x- and y-axis, respectively. Data points and lines represent experimental measurements and model fits to T3, respectively. Error bars represent 1 s.d. from the mean of at least three biological replicates. Stars denote datasets with a sum of mean squared errors greater than 0.15. Inferred inter-species interaction coefficients for the gLV model trained on T3. Gray and green edges denote negative (αij < 0) and positive (αij > 0) interaction coefficients. The edge width and node size represent the magnitude of the inter-species interaction coefficient and steady state monospecies abundance (xe = −μiαii−1), respectively. To highlight significant interactions, inter-species interaction coefficients with a magnitude less than 1e-5 were not displayed. Download figure Download PowerPoint Construction of a dynamic computational model of the community A generalizable modeling framework was developed to infer parameters from time-series measurements of relative abundance and total biomass (OD600). The generalized Lotka–Volterra (gLV) model represents microbial growth, intra-species interactions, and pairwise inter-species interactions and can be used to predict the dynamic behaviors of the community and analyze system properties such as stability and parameter sensitivity. The model equations are given by: where n, μ, αii, and αij represent the number of species, growth rates, intra-species, and inter-species interaction coefficients, respectively. To minimize overfitting of the data, a regularized parameter estimation method was implemented that penalized the magnitude of the parameter values (see Materials and Methods). Three training sets were evaluated based on predictive capability: (T1) M; (T2) M, PW1; and (T3) M, PW1, PW2. A range of regularization coefficient values (λ) was scanned to balance the goodness of fit to the training sets and degree of sparsity of the model (Appendix Fig S6). The parameterized gLV model trained on T3 captured the majority of pairwise community temporal responses (Fig 2A and B). However, the model did not accurately represent the dynamic behaviors of a set of communities including BH, EL; PC, CA; BO, CH; ER, BH; and PC, BH based on a threshold in the mean squared error between the model and data. Thresholding the magnitude of the inter-species interaction coefficients using a value of 1e-5 yielded a densely connected network whereby 77% of species pairs exhibited an interaction. The network connectivity varied between 75 and 79% for interaction coefficient thresholds ranging from 1e-6 to 1e-3. Interaction coefficients with a magnitude less than 1e-3 are not expected to change the steady state species abundance based on the inferred growth rate and interaction coefficient values. Of these interactions, 56 and 21% were negative and positive, respectively (Fig 2C). Negative interactions can arise from resource competition, biomolecular warfare, or production of toxic waste by-products. Positive interactions can originate from metabolite secretion or detoxification of the environment. Bacteroides (BO, BV, BU, and BT) displayed a net negative impact on the network, whereas EL, BH, and CH positively stimulated a large number of species (Appendix Fig S7A). Pairwise networks were enriched for unidirectional negative (−/0, 36%), bidirectional negative (−/−, 32%), and positive and negative (+/−, 26%) species couplings (Appendix Fig S7B). The contribution of each species to full community assembly in the model is dictated by a set of coupled ordinary differential equations that are a function of the monospecies growth rates, intra-species interactions, and outgoing and incoming inter-species interactions (see Materials and Methods). Therefore, a prediction about the role of each organism in community assembly requires simulation and analysis of the gLV model. FP was the recipient of five positive interactions, suggesting that the fitness of FP is coupled to the composition of the community (Appendix Fig S7A). To determine the contribution of each incoming positive interaction on FP abundance, we examined a 6-member gLV model composed of FP, BH, BU, BV, CH, and DP. The combined set of five positive inter-species interactions was required to alter FP abundance by more than twofold, and single and dual inter-species interactions moderately increased FP abundance at 72 h (Appendix Fig S7C). Therefore, FP represents an ecologically responsive organism that is significantly enhanced by the presence of multiple organisms in the community in these conditions. Corroborating this notion, FP exhibited significant variability in absolute abundance across PW1 communities and frequent coexistence with other organisms (Appendix Figs S3 and S5B). Strong positive or negative interactions can be deciphered by an enhancement or reduction in community productivity compared to a null model representing the sum of monospecies productivities (Foster & Bell, 2012). We computed the integral of biomass (OD600) over time to evaluate monospecies and pairwise community productivities (Appendix Fig S8). Our results showed that the productivities of 38% of pairwise consortia were less than twofold compared to the predictions based on the null models, consistent with the prevalence of negative interactions. Bacteroides pairwise communities BV, BU; BV, BO; BT, BU; BU, BO; BT, BV; and BT, BO exhibited significantly lower pairwise productivities compared to the null model, which was consistent with the inferred mutual inhibitory network topologies (Fig 2C). The productivities of EL, BH; EL, BU; EL, BT; EL, BO; EL, BV; and CH, ER were significantly enhanced in comparison with the predictions based on the null model. In the inferred network, five of these consortia (EL, BU; EL, BT; EL, BO; EL, BV; and CH, ER) displayed coupled negative and positive interaction topologies and EL, BH exhibited mutualism, demonstrating that both unidirectional and bidirectional positive interactions can augment community productivity. Hierarchical clustering of the gLV interaction coefficients showed that members of Bacteroides or Actinobacteria exhibited similar patterns in outgoing and incoming microbial interactions (Appendix Fig S9A and B). However, the Firmicutes clustering pattern did not reflect the phylogenetic relationships. Together, these data show that distantly related species can display similar microbial interactions (e.g., BH and DP or PC and CA) and closely related species can exhi

Abstract Access to web-based platforms has enabled scientists to perform research remotely. A critical aspect of mass spectrometry data analysis is the inspection, analysis, and visualization of the raw data to validate data quality and confirm statistical observations. We developed the GNPS Dashboard, a web-based data visualization tool, to facilitate synchronous collaborative inspection, visualization, and analysis of private and public mass spectrometry data remotely.

ABSTRACT Interactions between plants and their root-associated microbiome are important for determining host fitness during periods of stress. During drought, monoderm bacteria are more abundant in sorghum roots than in those of watered controls. Additionally, a reversion from monoderm to diderm dominance occurs in drought-stressed roots one week after rewatering. However, the mechanisms driving this rapid microbiome composition shift is currently unknown. To understand if changes in host metabolism are correlated with this shift, we employed 16S amplicon sequencing and metabolomics of root, rhizosphere, and soil at the peak of a preflowering drought and 24 hours after rewatering. The microbiomes of droughted roots, rhizospheres, and soils differed from watered controls, and shifts in bacterial composition were observed in root and rhizosphere 24 hours after rewatering, highlighting the rapid response of microbes to the cessation of drought. Next, we performed metabolomic profiling to identify putative drivers of this process. During drought, we observed a high abundance of abiotic stress response factors, including antioxidants, osmolytes, amino acids, and plant hormones. After rewatering, large shifts in metabolite abundances were observed in rhizosphere, whereas shifts in root and soil were subtle. In addition, pipecolic acid, a well-characterized systemic acquired resistance signalling compound, was enriched in roots and rhizosphere during drought. We found that exogenous application of pipecolic acid suppresses root growth via a systemic acquired resistance-independent mechanism. Collectively, these data provide a comprehensive characterization of metabolite shifts across three compartments during drought, and elucidate a potential role of pipecolic acid in the sorghum drought response. IMPORTANCE Plant-associated microbial communities shift in composition and contribute to host fitness during drought. In particular, Actinobacteria are enriched in plant roots and rhizosphere during drought. However, the mechanisms plants use to drive this shift are poorly understood. Here we apply a combination of bacterial and metabolite profiling in root, rhizosphere, and soil during drought and drought-recovery to investigate potential contributions of host metabolism towards shifts in bacterial composition. Our results demonstrate that drought alters metabolic profiles and that the response to rewatering differs between compartments; we identify drought-responsive metabolites that are highly correlated with Actinobacteria abundance. Furthermore, our study reports for the first time that pipecolic acid is a drought-enriched metabolite in sorghum roots. We demonstrate that exogenous application of pipecolic acid is able to provoke one of the classic drought responses in roots, root growth suppression, and that this activity functions independently from the systemic acquired resistance pathway.

Summary Exometabolomics is an approach to assess how microorganisms alter their environments through the depletion and secretion of chemical compounds. Comparisons of inoculated with uninoculated media can be used to provide direct biochemical observations on depleted and secreted metabolites which can be used to predict resource competition, cross-feeding and secondary metabolite production in microbial isolates and communities. This approach is most powerful when used with defined media that enable tracking of all depleted metabolites. However, microbial growth media have traditionally been developed for the isolation and growth of microorganisms but not metabolite utilization profiling through LC-MS/MS. Here, we describe the construction of a defined medium, the Northen Lab Defined Medium (NLDM), that not only supports the growth of diverse bacteria but is defined and therefore suited for exometabolomic experiments. Metabolites included in NLDM were selected based on their presence in R2A medium and soil, elemental stoichiometry requirements, as well as knowledge of metabolite usage by different bacteria. We found that NLDM supported the growth of 53 phylogenetically diverse soil bacterial isolates and all of its metabolites were trackable through LC–MS/MS analysis. These results demonstrate the viability and utility of the constructed NLDM medium for cultivating and characterizing diverse microbial isolates and communities. Originality-Significance Statement We build a defined medium based on the metabolite composition of R2A medium and soil, elemental stoichiometry requirements, and knowledge of metabolite usage by different bacteria. The newly formulated defined medium was evaluated on its ability to support the growth of soil isolates and its application for metabolite utilization profiling. We found that of 53 phylogenetically diverse soil bacterial isolates grew on the defined medium and all of its metabolites were trackable through LC–MS/MS analysis. This demonstrates the viability and utility of the constructed defined medium for cultivating and characterizing diverse microbial isolates and communities.

Abstract Plants exude large quantities of rhizosphere metabolites that can modulate composition and activity of microbial communities in response to environmental stress. While rhizodeposition dynamics have been associated with rhizosphere microbiome succession, and may be particularly impactful in stressful conditions, specific evidence of these connections has rarely been documented. Here, we grew the bioenergy crop switchgrass ( Panicum virgatum ) in a marginal soil, under nutrient limited, moisture limited, +nitrogen (N), and +phosphorus (P) conditions, to identify links between rhizosphere chemistry, microbiome dynamics, and abiotic stressors. To characterize links between rhizosphere microbial communities and metabolites, we used 16S rRNA amplicon sequencing and LC-MS/MS-based metabolomics. We measured significant changes in rhizosphere metabolite profiles in response to abiotic stress and linked them to changes in microbial communities using network analysis. N-limitation amplified the abundance of aromatic acids, pentoses, and their derivatives in the rhizosphere, and their enhanced availability was linked to the abundance of diverse bacterial lineages from Acidobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, and Alphaproteobacteria. Conversely, N-amended conditions enhanced the availability of N-rich rhizosphere compounds, which coincided with proliferation of Actinobacteria. Treatments with contrasting N availability differed greatly in the abundance of potential keystone metabolites; serotonin, ectoine, and acetylcholine were particularly abundant in N-replete soils, while chlorogenic, cinnamic, and glucuronic acids were found in N-limited soils. Serotonin, the keystone metabolite we identified with the largest number of links to microbial taxa, significantly affected root architecture and growth of rhizosphere microorganisms, highlighting its potential to shape microbial community and mediate rhizosphere plant-microbe interactions. Significance Plants and microorganisms release metabolites that mediate rhizosphere host-microbe interactions and modulate plant adaptation to environmental stresses. However, the molecular mechanisms that underpin rhizosphere metabolite-microbiome dynamics, their functional relationships, and the biological role of plant- or microbial-produced soil metabolites remain largely unknown. Here, we found the abundances of specific classes of rhizosphere soil metabolites were responsive to abiotic stressors, and also connected to specific shifts in the rhizosphere microbial community and plant phenotypes. We propose a suite of understudied rhizosphere compounds as keystone metabolites that may structure the rhizosphere microbiome and influence plant metabolism in response to nutrient availability. These links between rhizosphere metabolites and microbial communities point to research avenues where we might leverage plant-microbe interactions to engineer enhanced rhizosphere microbiome function, plant and ecosystem health.

Summary Root exudation has been extensively studied due to its importance in soil carbon cycling and in supporting growth of soil microbes. However, the extent and dynamics of plant uptake of exogenous metabolites is poorly understood. To gain new insights into these processes we used 13 C-tracing to characterize plant uptake of exometabolites across a panel of diverse plant species ( Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Lotus japonicus, Panicum virgatum , and Kalanchoe fedtschenkoi ) grown in sterile hydroponic cultures. The uptake of exometabolites accounted for 23% of the overall B. distachyon carbon budget, and we identified 33 metabolites that were taken up by plants. Counterintuitively, many metabolites had higher uptake rates during the day vs. night. Thirteen of the metabolites from root exudates were found to promote root growth in A. thaliana , including hydroxybenzoate, threonate, N -acetyl-glucosamine, and uracil. Together these results indicate that the root uptake of organics can account for a significant portion of the plant carbon budget and that exogenous small molecules used by plants alter root growth with implications for plant nutrition, organic farming, soil nutrient cycling, and rhizosphere community dynamics.

Summary Protection from excess solar radiation and access to sufficient water are important problems for terrestrial plants to solve. Desiccation tolerance (DT), defined as the ability to equilibrate to dry air and resume normal metabolic activity after rehydration, allows organisms to survive dry periods by limiting metabolic activity to periods of moisture availability. We compared separate and combined effects of chronic ultraviolet radiation (UVR) treatments (UV-A and UV-A/B) and a dehydration treatment (as a surrogate for desiccation) in the mosses Syntrichia ruralis and S. caninervis to uncover the nature of correlation between DT and UVR tolerance (UVRT). Using a fully factorial experiment with combined transcriptomics and metabolomics, we tested for cross-talk (overlap in signaling pathways in response to different stressors but separate mechanisms of protection) in the genetic underpinnings of DT and UVRT and cross-tolerance (overlap in the mechanism of protection) these two stressors. Shared transcriptomic response to the two stressors with no significant interaction between them suggested cross-talk between UVRT and DT for S. caninervis . Phenolic metabolites and transcripts were involved in the response to UVR and dehydration in both species. Some candidate UVRT genes and metabolites were induced by UVR in S. ruralis , but not S. caninervis , supporting the hypothesis that S. ruralis has a more plastic, acclimatable UVR response than S. caninervis , and that these differences are predictable by their unique interaction with these stressors as poikilohydric organisms.

Understanding the distribution of hundreds of thousands of plant metabolites across the plant kingdom presents a challenge. To address this, we curated publicly available LC-MS/MS data from 19,075 plant extracts and developed the plantMASST reference database encompassing 246 botanical families, 1,469 genera, and 2,793 species. This taxonomically focused database facilitates the exploration of plant-derived molecules using tandem mass spectrometry (MS/MS) spectra. This tool will aid in drug discovery, biosynthesis, (chemo)taxonomy, and the evolutionary ecology of herbivore interactions.

ABSTRACT Pseudomonas species are ubiquitous in nature and include numerous medically, agriculturally and technologically beneficial strains of which the interspecific interactions are of great interest for biotechnologies. Specifically, co-cultures containing Pseudomonas stutzeri have been used for bioremediation, biocontrol, aquaculture management and wastewater denitrification. Furthermore, the use of P. stutzeri biofilms, in combination with consortia based approaches, may offer advantages for these processes. Understanding the interspecific interaction within biofilm co-cultures or consortia provides a means for improvement of current technologies. However, the investigation of biofilm based consortia has been limited. We present an adaptable and scalable method for the analysis of macroscopic interactions (colony morphology, inhibition and invasion) between colony forming bacterial strains using an automated printing method followed by analysis of the genes and metabolites involved in the interactions. Using Biofilm Interaction Mapping and Analysis (BIMA), these interactions were investigated between P. stutzeri strain RCH2, a denitrifier isolated from chromium (VI) contaminated soil, and thirteen other species of pseudomonas isolated from non-contaminated soil. The metabolites and genes associated with both active co-culture growth and inhibitory growth were investigated using mass spectrometry based metabolomics and mutant fitness profiling of a DNA-barcoded mutant library. One interaction partner, Pseudomonas fluorescens N1B4 was selected for mutant fitness profiling; with this approach four genes of importance were identified and the effects on interactions were evaluated with deletion mutants and metabolomics. IMPORTANCE The Biofilm Interaction Mapping and Analysis (BIMA) methodology provides a way to rapidly screen for positive and negative interspecific interactions, followed by an analysis of the genes and metabolites that may be involved. Knowledge of these may offer opportunities for engineered strains with improved function in biotechnology systems. P. stutzeri , an organism with wide-spread utilization in consortia based biotechnologies, was used to demonstrate the utility of this approach. Where little is known about the factors influencing biofilm based interactions, elucidation of the genes and metabolites involved allows for better control of the system for improved function or yield.