Summary Walking is a fundamental mode of locomotion, yet its neural correlates are unknown at brain-wide scale in any animal. We use volumetric two-photon imaging to map neural activity associated with walking across the entire brain of Drosophila . We detect locomotor signals in approximately 40% of the brain, identify a global signal associated with the transition from rest to walking, and define clustered neural signals selectively associated with changes in forward or angular velocity. These networks span functionally diverse brain regions, and include regions that have not been previously linked to locomotion. We also identify time-varying trajectories of neural activity that anticipate future movements, and that represent sequential engagement of clusters of neurons with different behavioral selectivity. These motor maps suggest a dynamical systems framework for constructing walking maneuvers reminiscent of models of forelimb reaching in primates and set a foundation for understanding how local circuits interact across large-scale networks.

Summary Neural circuits must both execute the behavioral repertoire of individuals and account for behavioral variation across species. Understanding how this variation emerges over evolutionary time requires large-scale phylogenetic comparisons of behavioral repertoires. Here, we describe the evolution of walking in fruit flies by capturing high-resolution, unconstrained movement from 13 species and 15 strains of drosophilids. We find that walking can be captured in a universal behavior space, the structure of which is evolutionarily conserved. However, the occurrence of, and transitions between, specific movements have evolved rapidly, resulting in repeated convergent evolution in the temporal structure of locomotion. Moreover, a meta-analysis demonstrates that many behaviors evolve more rapidly than other traits. Thus, the architecture and physiology of locomotor circuits can both execute precise individual movements in one species and simultaneously support rapid evolutionary changes in the temporal ordering of these modular elements across clades.

Abstract Quantitative comparison of brain-wide neural dynamics across different experimental conditions often requires precise alignment to a common set of anatomical coordinates. While such approaches are routinely applied in functional magnetic resonance imaging (fMRI), registering in vivo fluorescence imaging data to ex vivo-derived reference atlases is challenging, given the many differences in imaging modality, microscope specification, and sample preparation. Moreover, in many systems, animal to animal variation in brain structure limits registration precision. Using the highly stereotyped architecture of the fruit fly brain as a model, we overcome these challenges by building a reference atlas based directly on in vivo multiphoton-imaged brains, called the Functional Drosophila Atlas (FDA). We then develop a novel two-step pipeline, BrIdge For Registering Over Statistical Templates (BIFROST), for transforming neural imaging data into this common space, and for importing ex vivo resources, such as connectomes. Using genetically labeled cell types to provide ground truth, we demonstrate that this method allows voxel registration with micron precision. Thus, this method provides a generalizable pipeline for registering neural activity datasets to one another, allowing quantitative comparisons across experiments, microscopes, genotypes, and anatomical atlases, including connectomes.

Locomotion involves rhythmic limb movement patterns that originate in circuits outside the brain. Purposeful locomotion requires descending commands from the brain, but we do not understand how these commands are structured. Here we investigate this issue, focusing on the control of steering in walking Drosophila. First, we describe different limb "gestures" associated with different steering maneuvers. Next, we identify a set of descending neurons whose activity predicts steering. Focusing on two descending cell types downstream from distinct brain networks, we show that they evoke specific limb gestures: one lengthens strides on the outside of a turn, while the other attenuates strides on the inside of a turn. Notably, a single descending neuron can have opposite effects during different locomotor rhythm phases, and we identify networks positioned to implement this phase-specific gating. Together, our results show how purposeful locomotion emerges from brain cells that drive specific, coordinated modulations of low-level patterns.

Understanding how the visual system encodes natural scenes is a fundamental goal of sensory neuroscience. We show here that a three-layer network model predicts the retinal response to natural scenes with an accuracy nearing the fundamental limits of predictability. The model’s internal structure is interpretable, in that model units are highly correlated with interneurons recorded separately and not used to fit the model. We further show the ethological relevance to natural visual processing of a diverse set of phenomena of complex motion encoding, adaptation and predictive coding. Our analysis uncovers a fast timescale of visual processing that is inaccessible directly from experimental data, showing unexpectedly that ganglion cells signal in distinct modes by rapidly (< 0.1 s) switching their selectivity for direction of motion, orientation, location and the sign of intensity. A new approach that decomposes ganglion cell responses into the contribution of interneurons reveals how the latent effects of parallel retinal circuits generate the response to any possible stimulus. These results reveal extremely flexible and rapid dynamics of the retinal code for natural visual stimuli, explaining the need for a large set of interneuron pathways to generate the dynamic neural code for natural scenes.

The ability to act voluntarily is fundamental to animal behavior. For example, self-directed movements are critical to exploration, particularly in the absence of external sensory signals that could shape a trajectory. However, how neural networks might plan future changes in direction in the absence of salient sensory cues is unknown. Here we use volumetric two-photon imaging to map neural activity associated with walking across the entire brain of the fruit fly Drosophila, register these signals across animals with micron precision, and generate a dataset of ~20 billion neural measurements across thousands of bouts of voluntary movements. We define spatially clustered neural signals selectively associated with changes in forward and angular velocity, and reveal that turning is associated with widespread asymmetric activity between brain hemispheres. Strikingly, this asymmetry in interhemispheric dynamics emerges more than 10 seconds before a turn within a specific brain region associated with motor control, the Inferior Posterior Slope (IPS). This early, local difference in neural activity predicts the direction of future turns on a trial-by-trial basis, revealing long-term motor planning. As the direction of each turn is neither trained, nor guided by external sensory cues, it must be internally determined. We therefore propose that this pre-motor center contains a neural substrate of volitional action.