Intratumoral variability is a seminal feature of human tumors contributing to tumor progression and response to treatment. Current technologies are unsuitable to accurately track phenotypes and subclonal evolution within tumors, especially in response to genetic manipulations. Here, we developed epitope combinatorial tags (EpicTags), which we coupled to multiplexed ion beam imaging (EpicMIBI) for in situ tracking of barcodes within tissue microenvironments. Using this platform, we dissected the spatial component of cell lineages and phenotypes in a xenograft model of small-cell lung cancer. We observed emergent properties from mixed clones leading to the preferential expansion of subclonal patches for both neuroendocrine and non-neuroendocrine cancer cell states in this model. In tumors harboring a fraction of PTEN-deficient cancer cells, we uncovered a non-autonomous increase of subclonal patch size in PTEN wildtype cancer cells. EpicMIBI can facilitate in situ interrogation of cell-intrinsic and cell-extrinsic processes involved in intratumoral heterogeneity.

ABSTRACT Small cell lung cancer (SCLC) is a recalcitrant neuroendocrine carcinoma with dismal survival outcomes. A major barrier in the field has been the relative paucity of human tumors studied. Here we provide an integrated analysis of 3,600 “real-world” SCLC cases. This large cohort allowed us to identify new recurrent alterations and new genetic subtypes, including STK11- mutant tumors (1.7%) and TP53/RB1 wild-type tumors (5.5%), of which 12.7% were human papillomavirus-positive. In our cohort, gene amplifications on 4q12 are associated with increased overall survival while CCNE1 amplification is associated with decreased overall survival. We also identify more frequent alterations in the PTEN pathway in brain metastases. Finally, profiling cases of SCLC containing oncogenic drivers typically associated with NSCLC demonstrates that SCLC transformation may occur across multiple distinct molecular cohorts of NSCLC. These novel and unsuspected genetic features of SCLC may help personalize treatment approaches for this fatal form of cancer. STATEMENT OF SIGNIFICANCE Minimal changes in therapy and survival outcomes have occurred in SCLC for the past four decades. The identification of new genetic subtypes, novel recurrent mutations, and an improved understanding of the mechanisms of transformation to SCLC from NSCLC may guide the development of personalized therapies for subsets of patients with SCLC.

The disialoganglioside GD2 is consistently overexpressed in neuroblastoma and osteosarcoma, and is variably expressed in other sarcomas, gliomas, neuroendocrine tumors, and epithelial cancers. Anti-GD2 antibodies have improved the survival rates of patients with neuroblastoma only when administered as part of intense chemotherapy-based cytotoxic regimens, which are associated with debilitating late effects including hearing loss, growth retardation, and secondary leukemias. Despite broad expression of GD2 on osteosarcoma, anti-GD2 antibody has not mediated significant antitumor activity in that disease or any other GD2+ cancers. CD47 is a checkpoint molecule overexpressed on tumor cells that inhibits macrophage activity, and CD47 blockade has demonstrated promising clinical activity in early human trials. We investigated whether anti-CD47 antibody could enhance the efficacy of anti-GD2 antibody in neuroblastoma and other GD2+ malignancies. We demonstrate substantial synergy of these two agents, resulting in the recruitment of tumor associated macrophages (TAMs) to mediate robust and durable anti-tumor responses. The responses are driven by GD2-specific factors that reorient the balance of macrophage activity towards phagocytosis of tumor cells, including disruption of a newly described GD2:Siglec-7 axis. These results demonstrate the unique synergy of combining anti-GD2 with anti-CD47, which has the potential to significantly enhance outcomes for children with neuroblastoma and osteosarcoma and will soon be investigated in a first-in-human clinical trial.

Abstract Every type of cell in an animal maintains a specific size, which likely contributes to its ability to perform its physiological functions. While some cell size control mechanisms are beginning to be elucidated through studies of cultured cells, it is unclear if and how such mechanisms control cell size in an animal. For example, it was recently shown that RB, the retinoblastoma protein, was diluted by cell growth in G1 to promote size-dependence of the G1/S transition. However, it remains unclear to what extent the RB-dilution mechanism controls cell size in an animal. We therefore examined the contribution of RB-dilution to cell size control in the mouse liver. The RB-dilution model has two requirements. First, manipulations changing RB concentration drive corresponding changes in cell size, and second, the endogenous RB concentration decreases with cell size in G1. We found that both these requirements were met. Genetic perturbations decreasing RB protein concentrations through inducible shRNA expression or through liverspecific Rb1 knockout reduced hepatocyte size, while perturbations increasing RB protein concentrations in an Fah −/− mouse model increased hepatocyte size. Moreover, RB concentration decreased in larger G1 hepatocytes while the concentrations of the cell cycle activators Cyclin D1 and E2f1 remained relatively constant. Lastly, we tested how Rb1 manipulations affected G1/S cell size control in primary hepatocytes using live cell imaging. Loss of Rb1 weakened cell size control, i.e., reduced the inverse correlation between how much cells grew in G1 and how large they were at birth. Taken together, our results show that an RB- dilution mechanism contributes to cell size control in the mouse liver by linking cell growth to the G1/S transition.

ABSTRACT Brain metastasis is a major cause of morbidity and mortality in cancer patients. Here we investigated mechanisms allowing small-cell lung cancer (SCLC) cells to grow in the brain. We show that SCLC cells undergo a cell state transition towards neuronal differentiation during tumor progression and metastasis, and that this neuronal mimicry is critical for SCLC growth in the brain. Mechanistically, SCLC cells re-activate astrocytes, which in turn promote SCLC growth by secreting neuronal pro-survival factors such as SERPINE1. We further identify Reelin, a molecule important in brain development, as a factor secreted by SCLC cells to recruit astrocytes to brain metastases in mice. This recruitment of astrocytes by SCLC was recapitulated in assembloids between SCLC aggregates and human cortical spheroids. Thus, SCLC brain metastases grow by co-opting mechanisms involved in reciprocal neuron-astrocyte interactions during development. Targeting such developmental programs activated in this cancer ecosystem may help treat brain metastases.

ABSTRACT Mechanistic models of biological processes can help explain observed phenomena and predict response to a perturbation. A mathematical model is typically constructed using expert knowledge and informal reasoning to generate a mechanistic explanation for a given observation. Although this approach works well for simple systems with abundant data and well-established principles, quantitative biology is often faced with a dearth of both data and knowledge about a process, thus making it challenging to identify and validate all possible mechanistic hypothesis underlying a system behavior. To overcome these limitations, we introduce a Bayesian multimodel inference (Bayes-MMI) methodology, which quantifies how mechanistic hypotheses can explain a given experimental datasets, and concurrently, how each dataset informs a given model hypothesis, thus enabling hypothesis space exploration in the context of available data. We demonstrate this approach to probe standing questions about heterogeneity, lineage plasticity, and cell-cell interactions in tumor growth mechanisms of small cell lung cancer (SCLC). We integrate three datasets that each formulated different explanations for tumor growth mechanisms in SCLC, apply Bayes-MMI and find that the data supports model predictions for tumor evolution promoted by high lineage plasticity, rather than through expanding rare stem-like populations. In addition, the models predict that in the presence of SCLC-N or SCLC-A2 cells, the transition from SCLC-A to SCLC-Y through an intermediate is decelerated. Together, these predictions provide a testable hypothesis for observed juxtaposed results in SCLC growth and a mechanistic interpretation for tumor recalcitrance. AUTHOR SUMMARY To make a mathematical model, an investigator needs to know and incorporate biological relationships present in the system of interest. However, if we don’t know the exact relationships, how can we build a model? Building a single model may include spurious relationships or exclude important ones, so model selection enables us to build multiple, incorporating various combinations of biological features and the relationships between them. Each biological feature represents a distinct hypothesis, which can be investigated via model fitting to experimental data. We aim to improve upon the information theoretic framework of model selection by incorporating Bayesian elements. We apply our approach to small cell lung cancer (SCLC), using multiple datasets, to address hypotheses about cell-cell interactions, phenotypic transitions, and tumor makeup across experimental model systems. Incorporating Bayesian inference, we can add into model selection an assessment of whether these hypotheses are likely or unlikely, or even whether the data enables assessment of a hypothesis at all. Our analysis finds that SCLC is likely highly plastic, with cells able to transition phenotypic identities easily. These predictions could help explain why SCLC is such a difficult disease to treat, and provide the basis for further experiments.

Somatic genome editing in mouse models has increased our understanding of the in vivo effects of genetic alterations in areas ranging from neuroscience to cancer biology and beyond. However, existing models have been restricted in their ability to create multiple targeted edits, which has limited investigations into complex genetic interactions that underlie development, homeostasis, and disease. To accelerate and expand the generation of complex genotypes in somatic cells, we generated transgenic mice with Cre-regulated and constitutive expression of enhanced Acidaminococcus sp. Cas12a (enAsCas12a), an RNA-guided endonuclease with unique attributes that enable simple targeting of multiple genes. In these mice, enAsCas12a-mediated somatic genome editing robustly generated compound genotypes, as exemplified by the initiation of oncogene-negative lung adenocarcinoma, small-cell lung cancer, and a canonical genotype of pancreatic ductal adenocarcinoma, all driven by homozygous inactivation of trios of tumor suppressor genes. We further integrated these modular crRNA arrays with clonal barcoding to quantify the size and number of tumors with each array. These Cas12a alleles will enable the rapid generation of disease models and broadly facilitate the high-throughput investigation of coincident genomic alterations in somatic cells in vivo .

Abstract Introduction Vasculogenic mimicry (VM), the process of tumor cell trans-differentiation to endow endothelial-like characteristics supporting de novo vessel formation, is associated with poor prognosis in several tumor types, including small cell lung cancer (SCLC). In genetically engineered mouse models (GEMMs) of SCLC, NOTCH and MYC co-operate to drive a neuroendocrine (NE) to non-NE phenotypic switch and co-operation between NE and non-NE cells is required for metastasis. Here, we define the phenotype of VM-competent cells and molecular mechanisms underpinning SCLC VM using circulating tumor cell-derived explant (CDX) models and GEMMs. Methods We analysed perfusion within VM vessels and their association with NE and non-NE phenotypes using multiplex immunohistochemistry in CDX and GEMMs. VM-proficient cell subpopulations in ex vivo cultures were molecularly profiled by RNA sequencing and mass spectrometry. We evaluated their 3D structure and defined collagen-integrin interactions. Results We show that VM vessels are present in 23/25 CDX models and in 2 GEMMs. Perfused VM vessels support tumor growth and only Notch-active non-NE cells are VM-competent in vivo and ex vivo , expressing pseudohypoxia, blood vessel development and extracellular matrix (ECM) organization signatures. On Matrigel, VM-primed non-NE cells re-model ECM into hollow tubules in an integrin β1-dependent process. Conclusions We identify VM as an exemplar of functional heterogeneity and plasticity in SCLC and these findings take significant steps towards understanding the molecular events that enable VM. These results support therapeutic co-targeting of both NE and non-NE cells to curtail SCLC progression and to improve SCLC patient outcomes in future.

Abstract Small Cell Lung Cancer (SCLC) tumors are made up of distinct cell subpopulations, including neuroendocrine (NE) and non-NE cells. While secreted factors from non-NE SCLC cells have been shown to support the growth of the NE cells, the underlying molecular factors are not well understood. Here, we show that exosome-type small extracellular vesicles (SEVs) secreted from non-NE SCLC cells promote adhesion and survival of NE SCLC cells. Proteomic analysis of purified small EVs revealed that extracellular matrix (ECM) proteins and integrins are highly enriched in small EVs of non-NE cells whereas nucleic acid-binding proteins are enriched in small EVs purified from NE cells. Addition of select purified ECM proteins identified in purified EVs, specifically fibronectin, laminin 411, and laminin 511, were able to substitute for the role of non-NE-derived SEVs in promoting adhesion, survival, and tumorigenicity of NE SCLC cells. Those same proteins were differentially expressed by human SCLC subtypes. These data suggest that ECM-carrying SEVs secreted by non-NE cells play a key role in supporting SCLC tumor growth and survival.

Summary Neural activity is increasingly recognized as a critical regulator of cancer growth. In the brain, neuronal activity robustly influences glioma growth both through paracrine mechanisms and through electrochemical integration of malignant cells into neural circuitry via neuron-to-glioma synapses, while perisynaptic neurotransmitter signaling drives breast cancer brain metastasis growth. Outside of the CNS, innervation of tumors such as prostate, breast, pancreatic and gastrointestinal cancers by peripheral nerves similarly regulates cancer progression. However, the extent to which the nervous system regulates lung cancer progression, either in the lung or when metastatic to brain, is largely unexplored. Small cell lung cancer (SCLC) is a lethal high-grade neuroendocrine tumor that exhibits a strong propensity to metastasize to the brain. Here we demonstrate that, similar to glioma, metastatic SCLC cells in the brain co-opt neuronal activity-regulated mechanisms to stimulate growth and progression. Optogenetic stimulation of cortical neuronal activity drives proliferation and invasion of SCLC brain metastases. In the brain, SCLC cells exhibit electrical currents and consequent calcium transients in response to neuronal activity, and direct SCLC cell membrane depolarization is sufficient to promote the growth of SCLC tumors. In the lung, vagus nerve transection markedly inhibits primary lung tumor formation, progression and metastasis, highlighting a critical role for innervation in overall SCLC initiation and progression. Taken together, these studies illustrate that neuronal activity plays a crucial role in dictating SCLC pathogenesis in both primary and metastatic sites.