Summary

 Neurons transmit information to distant brain regions via long-range axonal projections. In the mouse, area-to-area connections have only been systematically mapped using bulk labeling techniques, which obscure the diverse projections of intermingled single neurons. Here we describe MAPseq (Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing), a technique that can map the projections of thousands or even millions of single neurons by labeling large sets of neurons with random RNA sequences ("barcodes"). Axons are filled with barcode mRNA, each putative projection area is dissected, and the barcode mRNA is extracted and sequenced. Applying MAPseq to the locus coeruleus (LC), we find that individual LC neurons have preferred cortical targets. By recasting neuroanatomy, which is traditionally viewed as a problem of microscopy, as a problem of sequencing, MAPseq harnesses advances in sequencing technology to permit high-throughput interrogation of brain circuits.

PCR permits the exponential and sequence-specific amplification of DNA, even from minute starting quantities. PCR is a fundamental step in preparing DNA samples for high-throughput sequencing. However, there are errors associated with PCR-mediated amplification. Here we examine the effects of four important sources of error—bias, stochasticity, template switches and polymerase errors—on sequence representation in low-input next-generation sequencing libraries. We designed a pool of diverse PCR amplicons with a defined structure, and then used Illumina sequencing to search for signatures of each process. We further developed quantitative models for each process, and compared predictions of these models to our experimental data. We find that PCR stochasticity is the major force skewing sequence representation after amplification of a pool of unique DNA amplicons. Polymerase errors become very common in later cycles of PCR but have little impact on the overall sequence distribution as they are confined to small copy numbers. PCR template switches are rare and confined to low copy numbers. Our results provide a theoretical basis for removing distortions from high-throughput sequencing data. In addition, our findings on PCR stochasticity will have particular relevance to quantification of results from single cell sequencing, in which sequences are represented by only one or a few molecules.

Sleep quality declines with age; however, the underlying mechanisms remain elusive. We found that hyperexcitable hypocretin/orexin (Hcrt/OX) neurons drive sleep fragmentation during aging. In aged mice, Hcrt neurons exhibited more frequent neuronal activity epochs driving wake bouts, and optogenetic activation of Hcrt neurons elicited more prolonged wakefulness. Aged Hcrt neurons showed hyperexcitability with lower KCNQ2 expression and impaired M-current, mediated by KCNQ2/3 channels. Single-nucleus RNA-sequencing revealed adaptive changes to Hcrt neuron loss in the aging brain. Disruption of Kcnq2/3 genes in Hcrt neurons of young mice destabilized sleep, mimicking aging-associated sleep fragmentation, whereas the KCNQ-selective activator flupirtine hyperpolarized Hcrt neurons and rejuvenated sleep architecture in aged mice. Our findings demonstrate a mechanism underlying sleep instability during aging and a strategy to improve sleep continuity.

The neocortex is organized into distinct areas, whose interconnectivity underlies sensorimotor transformations and integration 1–7 . These behaviorally critical functions are mediated by intracortically-projecting neurons (ICPN), which are a heterogeneous population of cells sending axonal branches to distinct cortical areas as well as to subcortical targets 8–10 . Although population-based 11–14 and single-cell 15–19 intracortical wiring diagrams are being identified, the transcriptional signatures corresponding to single-cell axonal projections of ICPN to multiple sites remain unknown. To address this question, we developed a high-throughput approach, “Connect ID ”, to link connectome and transcriptome in single neurons. Connect ID combines MAPseq projection mapping 17,20 (to identify single-neuron multiplex projections) with single-cell RNA sequencing (to identify corresponding gene expression). Using primary somatosensory cortex (S1) ICPN as proof-of-principle neurons, we identify three cardinal targets: (1) the primary motor cortex (M1), (2) the secondary somatosensory cortex (S2) and (3) subcortical targets (Sub). Using Connect ID , we identify transcriptional modules whose combined activities reflect multiplex projections to these cardinal targets. Based on these findings, we propose that the combinatorial activity of connectivity-defined transcriptional modules serves as a generic molecular mechanism to create diverse axonal projection patterns within and across neuronal cell types.

Abstract How have complex brains evolved from simple circuits? Here we investigated brain region evolution at cell type resolution in the cerebellar nuclei (CN), the output structures of the cerebellum. Using single-nucleus RNA sequencing in mice, chickens, and humans, as well as STARmap spatial transcriptomic analysis and whole-CNS projection tracing in mice, we identified a conserved cell type set containing two classes of region-specific excitatory neurons and three classes of region-invariant inhibitory neurons. This set constitutes an archetypal CN that was repeatedly duplicated to form new regions. Interestingly, the excitatory cell class that preferentially funnels information to lateral frontal cortices in mice becomes predominant in the massively expanded human Lateral CN. Our data provide the first characterization of CN transcriptomic cell types in three species and suggest a model of brain region evolution by duplication and divergence of entire cell type sets.

We analyze the scaling and cost-performance characteristics of current and projected connectomics approaches, with reference to the potential implications of recent advances in diverse contributing fields. Three generalized strategies for dense connectivity mapping at the scale of whole mammalian brains are considered: electron microscopic axon tracing, optical imaging of combinatorial molecular markers at synapses, and bulk DNA sequencing of trans-synaptically exchanged nucleic acid barcode pairs. Due to advances in parallel-beam instrumentation, whole mouse brain electron microscopic image acquisition could cost less than $100 million, with total costs presently limited by image analysis to trace axons through large image stacks. Optical microscopy at 50 to 100 nm isotropic resolution could potentially read combinatorially multiplexed molecular information from individual synapses, which could indicate the identifies of the pre-synaptic and post-synaptic cells without relying on axon tracing. An optical approach to whole mouse brain connectomics may be achievable for less than $10 million and could be enabled by emerging technologies to sequence nucleic acids in-situ in fixed tissue via fluorescent microscopy. Novel strategies relying on bulk DNA sequencing, which would extract the connectome without direct imaging of the tissue, could produce a whole mouse brain connectome for $100k to $1 million or a mouse cortical connectome for $10k to $100k. Anticipated further reductions in the cost of DNA sequencing could lead to a $1000 mouse cortical connectome.

Abstract The structure of neuronal connectivity often provides insights into the relevant stimulus features, such as spatial location, orientation, sound frequency, etc 1–6 . The olfactory system, however, appears to lack structured connectivity as suggested by reports of broad and distributed connections both from the olfactory bulb to the piriform cortex 7–22 and within the cortex 23–25 . These studies have inspired computational models of circuit function that rely on random connectivity 26–33 . It remains, nonetheless, unclear whether the olfactory connectivity contains spatial structure. Here, we use high throughput anatomical methods (MAPseq and BARseq) 34–38 to analyze the projections of 5,309 bulb and 30,433 piriform cortex output neurons in the mouse at single-cell resolution. We identify previously unrecognized spatial organization in connectivity along the anterior-posterior axis (A-P) of the piriform cortex. We find that both the bulb projections to the cortex and the cortical outputs are not random, but rather form gradients along the A-P axis. Strikingly, these gradients are matched : bulb neurons targeting a given location within the piriform cortex co-innervate extra-piriform regions that receive strong inputs from neurons within that piriform locus. We also identify signatures of local connectivity in the piriform cortex. Our findings suggest an organizing principle of matched direct and indirect olfactory pathways that innervate extra-piriform targets in a coordinated manner, thus supporting models of information processing that rely on structured connectivity within the olfactory system.