Abstract Concerns about external validity of rodent models and translation of findings across species are often based on narrow investigations of populations with limited diversity. Sources of individual variation – including genetics and sex – are only infrequently encompassed in model organism studies. As with most complex diseases, risk for cocaine use disorder is subject to considerable inter-individual variation. Explicit inclusion of individual differences in rodent research may reveal conserved phenotypes and molecular systems relevant to human addiction. We surveyed cocaine-related traits in both males and females of eight inbred mouse strains whose genomes collectively capture 90% of the genetic diversity of the mouse species. Across these strains, individual differences explained a substantial proportion of variance in cocaine-responsive or cocaine response-predictive behavioral and physiological phenotypes. Wild-derived mouse strains often extended the phenotypic ranges of these behaviors beyond what is observed in conventional laboratory strains. Striatum transcriptional responses to cocaine were also highly dependent upon strain and sex differences; most cocaine-responsive genes were differentially expressed in a manner moderated by strain, sex, or their combination. We compared the strain- and sex-mediated transcriptional responses to cocaine in mice to transcriptomic analysis of people with cocaine use disorder and found that mouse similarity to humans was highly dependent upon mouse genetic background and sex. Specifically, male WSB/EiJ mice and female NOD/ShiLtJ mice exhibited the greatest degree of neural transcriptional consilience with humans with cocaine use disorder. Model organism diversity thus represents a crucial source of biological information that can substantially improve external validity of neuropsychiatric research. Significance Statement Laboratory mice are widely used in research on neurobiological mechanisms of addiction, but most studies use a single strain and often sex of mice. To assess how individual differences in mice modulate addiction-related traits and how this impacts comparative analysis with humans, we studied cocaine-relevant behaviors and brain molecular correlates in both males and females of genetically diverse mouse strains. In this population, individual differences related to sex and/or genetics explain large proportions of differences in cocaine-related traits. Importantly, brain gene expression data demonstrated that some strains mimic human genomic states more readily than others. Individual differences thus represent a crucial and underdeveloped source of biological information about addiction mechanisms that may influence the translational utility of such studies.

Mouse embryonic stem cells (mESCs) cultured under controlled conditions occupy a stable ground state where pluripotency-associated transcriptional and epigenetic circuitry are highly active. However, mESCs from some genetic backgrounds exhibit metastability, where ground state pluripotency is lost in the absence of ERK1/2 and GSK3 inhibition. We dissected the genetic basis of metastability by profiling gene expression and chromatin accessibility in 185 genetically heterogeneous mESCs. We mapped thousands of loci affecting chromatin accessibility and/or transcript abundance, including eleven instances where distant QTL co-localized in clusters. For one cluster we identified Lifr transcript abundance as the causal intermediate regulating 122 distant genes enriched for roles in maintenance of pluripotency. Joint mediation analysis implicated a single enhancer variant ~10kb upstream of Lifr that alters chromatin accessibility and precipitates a cascade of molecular events affecting maintenance of pluripotency. We validated this hypothesis using reciprocal allele swaps, revealing mechanistic details underlying variability in ground state metastability in mESCs.

SUMMARY Diverse inbred mouse strains are among the foremost models for biomedical research, yet genome characterization of many strains has been fundamentally lacking in comparison to human genomics research. In particular, the discovery and cataloging of structural variants is incomplete, limiting the discovery of potentially causative alleles for phenotypic variation across individuals. Here, we utilized long-read sequencing to resolve genome-wide structural variants (SVs, variants ≥ 50 bp) in 20 genetically distinct inbred mice. We report 413,758 site-specific SVs that affect 13% (356 Mbp) of the current mouse reference assembly, including 510 previously unannotated variants which alter coding sequences. We find that 39% of SVs are attributed to transposable element (TE) variation accounting for 75% of bases altered by SV. We then utilized this callset to investigate the impact of TE heterogeneity on mouse embryonic stem cells (mESCs), and find multiple TE classes that influence chromatin accessibility across loci. We also identify strain-specific transcription start sites originating in polymorphic TEs that modify gene expression. Our work provides the first long-read based analysis of mouse SVs and illustrates that previously unresolved TEs underlie epigenetic and transcriptome differences in mESCs.

Abstract Drugs of abuse, including alcohol and stimulants like cocaine, produce effects that are subject to individual variability, and genetic variation accounts for at least a portion of those differences. Notably, research in both animal models and human subjects point towards reward sensitivity and impulsivity as being trait characteristics that predict relatively greater positive subjective responses to stimulant drugs. Here we describe use of the eight Collaborative Cross (CC) founder strains and multiple CC strains to examine the heritability of reward sensitivity and impulsivity traits, as well as genetic correlations between these measures and existing addiction-related phenotypes. Methods . Strains were all tested for activity in an open field and reward sensitivity (intake of chocolate BOOST®). Mice were then divided into two counterbalanced groups and underwent reversal learning (impulsive action and waiting impulsivity) or delay discounting (impulsive choice). Results . CC and founder mice demonstrate significant heritability for impulsive action, impulsive choice, waiting impulsivity, locomotor activity, and reward sensitivity, with each impulsive phenotype determined to be non-correlating, independent traits. This research was conducted within the broader, inter-laboratory effort of the Center for Systems Neurogenetics of Addiction (CSNA) to characterize CC and DO mice for multiple, cocaine abuse related traits. These data will facilitate the discovery of genetic correlations between predictive traits, which will then guide discovery of genes and genetic variants that contribute to addictive behaviors.

Abstract In mammals, the X and Y chromosomes share only small regions of homology called pseudo-autosomal regions (PAR) where pairing and recombination in spermatocytes can occur. Consequently, the sex chromosomes remain largely unsynapsed during meiosis I and are sequestered in a nuclear compartment known as the XY body where they are transcriptionally silenced in a process called meiotic sex chromosome inactivation (MSCI). MSCI mirrors meiotic silencing of unpaired chromatin (MSUC), the sequestration and transcriptional repression of unpaired DNA observed widely in eukaryotes. MSCI is initiated by the assembly of the axial elements of the synaptonemal complex (SC) comprising the structural proteins SYCP2 and SYCP3 followed by the ordered recruitment of DNA Damage Response (DDR) factors to effect gene silencing. However, the precise mechanism of how unsynapsed chromatin is detected in meiocytes is poorly understood. The sex chromosomes in eutherian mammals harbor multiple clusters of SYCP3 -like amplicons comprising the Xlr gene family, only a handful of which have been functionally studied. We used a shRNA-transgenic mouse model to create a deficiency in the testis-expressed multicopy Xlr3 genes to investigate their role in spermatogenesis. Here we show that knockdown of Xlr3 in mice leads to spermatogenic defects and a skewed sex ratio that can be traced to MSCI breakdown. Spermatocytes deficient in XLR3 form the XY body and the SC axial elements therein, but are compromised in their ability to recruit DDR components to the XY body. Author Summary A key event in the production of sperm is the pairing and synapsis of homologous chromosome pairs to facilitate genetic recombination during the first meiotic division. Chromosomal abnormalities that undermine pairing and synapsis in spermatocytes trigger a checkpoint that leads to removal of the abnormal cells via programmed cell death. In mammals, the sex chromosomes, X and Y, lack homology through most of their length and remain largely unpaired. To avoid triggering the checkpoint the X and Y are sequestered in a specialized nuclear compartment called the XY body. DNA damage response (DDR) proteins are recruited to the XY body in a highly ordered progression leading to repression of all gene transcription from the sex chromosomes. We show that knocking down expression of the X-linked SYCR3 -like gene, Xlr3, disrupts sex chromosome gene silencing by interfering with recruitment of DDR factors, leading to compromised sperm production.

Abstract Micronuclei, whole or fragmented chromosomes which are spatially separated from the main nucleus, are strongly associated with genomic instability and have been identified as drivers of tumorigenesis. Paradoxically, Kif18a mutant mice produce micronuclei due to unaligned chromosomes in vivo but do not develop spontaneous tumors, raising questions about whether all micronuclei contribute similarly to genomic instability and cancer. We report here that micronuclei in Kif18a mutant mice form stable nuclear envelopes. Challenging Kif18a mutant mice via deletion of the Trp53 gene led to formation of thymic lymphoma with elevated levels of micronuclei. However, loss of Kif18a had modest or no effect on survival of Trp53 homozygotes and heterozygotes, respectively. To further explore micronuclear envelope stability in KIF18A KO cells, we compared micronuclei induced via different insults in cultured cells. Micronuclei in KIF18A KO cells form stable nuclear envelopes characterized by increased recruitment of core and non-core nuclear envelope components and successful expansion of decondensing chromatin compared to those induced by microtubule drug washout or exposure to radiation. We also observed that lagging chromosomes, which lead to micronucleus formation, were positioned closer to the main chromatin masses, and further from the central spindle, in KIF18A KO cells. Our studies provide in vivo support to models suggesting that micronuclear fate depends on the sub-cellular location of late lagging chromosomes and suggest that not all micronuclei actively promote tumorigenesis.

Rorb encodes the Retinoic Acid Receptor-related orphan receptor beta. Mutations in either of the two transcripts of Rorb cause defects in multiple systems, including abnormal photoreceptor abundance and morphology in the retina and a characteristic high-stepper or duck-like gait arising from dysfunction of interneurons in the spinal cord. Rorb is also important for cortical development and cell fate specification in mice. Rorb variants segregate with epilepsy and comorbidities such as intellectual disability in numerous clinical cases. Here we describe five mouse strains with spontaneous mutations in Rorb identified by their gait phenotype. These mutations affect different domains and isoforms of Rorb, which correspond to the spectrum of anatomical and physiological phenotypes exhibited by these mice. Gene set analysis in Rorb mutants implicates pathways associated with development and nervous system function, and differential gene expression analysis indicates changes in numerous genes related to epilepsy, bipolar disorder, and autism spectrum disorder (ASD). Many of these genes and their protein products are known to interact during synapse formation and neuronal activity. These findings further illuminate the role of Rorb in nervous system development, provide further evidence for an association between Rorb and several neurological conditions, and describe an allelic series of Rorb mutant mice that will be useful for dissecting thalamocortical afferent(TCA) development, neural cell fate determination, and as animal models exhibiting transcriptomic shifts in neurological conditions such as epilepsy, bipolar disorder, and ASD.

Abstract Neural progenitor cells (NPC) represent potential cell transplantation therapies for CNS injuries. To understand how lesion environments influence transplanted NPC fate in vivo , we derived NPC expressing a ribosomal protein-hemagglutinin tag (RiboTag) for transcriptional profiling of transplanted NPC. Here, we show that NPC grafted into uninjured CNS generate cells that are transcriptionally similar to healthy astrocytes and oligodendrocyte lineages. In striking contrast, NPC transplanted into serum-exposed CNS lesions after stroke or spinal cord injury generate cells that share transcriptional, morphological and functional features with newly proliferated host astroglia that restrict inflammation and fibrosis and thereby protect adjacent neural tissue. Our findings reveal overlapping differentiation potentials of grafted NPC and proliferating host astrocytes; and show that in the absence of other interventions, non-cell autonomous cues in CNS lesions direct the differentiation of grafted NPC predominantly towards a naturally occurring neuroprotective wound repair astroglial phenotype.

Genetic background is a major driver of phenotypic variability in pluripotent stem cells (PSCs). Most studies of variation in PSCs have relied on transcript abundance as the primary molecular readout of cell state. However, little is known about how proteins, the primary functional units in the cell, vary across genetically diverse PSCs, how protein abundance relates to variation in other cell characteristics, and how genetic background confers these effects. Here we present a comprehensive genetic study characterizing the pluripotent proteome of 190 unique mouse embryonic stem cell lines (mESCs) derived from genetically heterogeneous Diversity Outbred (DO) mice. The quantitative proteome is highly variable across DO mESCs, and we identified differentially activated pluripotency-associated pathways in the proteomics data that were not evident in transcriptome data from the same cell lines. Comparisons of protein abundance to transcript levels and chromatin accessibility show broad co-variation across molecular layers and variable correlation across samples, with some lines showing high and others low correlation between these multi-omics datasets. Integration of these three molecular data types using multi-omics factor analysis revealed shared and unique drivers of quantitative variation in pluripotency-associated pathways. QTL mapping localized the genetic drivers of this quantitative variation to a number of genomic hotspots, and demonstrated that multi-omics data integration consolidates the influence of genetic signals shared across molecular traits to increase QTL detection power and overcome the limitations inherent in mapping individual molecular features. This study reveals transcriptional and post-transcriptional mechanisms and genetic interactions that underlie quantitative variability in the pluripotent proteome, and in so doing provides a regulatory map for mouse ESCs that can provide a rational basis for future mechanistic studies, including studies of human PSCs.

Abstract Impulsive behavior and impulsivity are heritable phenotypes that are strongly associated with risk for substance use disorders in human subjects. Consequently, identifying the neurogenetic mechanisms that influence impulsivity may also reveal novel biological insights into addiction vulnerability. Past studies from our laboratory using the BXD and Collaborative Cross (CC) recombinant inbred mouse panels have revealed that behavioral indicators of impulsivity measured in a reversal learning task are heritable and are genetically correlated with aspects of intravenous cocaine self-administration. Genome wide linkage studies in the BXD panel revealed a quantitative trait locus (QTL) on chromosome 10, but the specific genes affecting this trait remain elusive. To achieve greater precision in our mapping efforts, we have turned to Diversity Outbred (DO) mice. A total of 392 DO mice (230 males, 295 females) were successfully phenotyped using the same reversal learning test utilized in our earlier studies. Our primary indicator of impulsive responding, a measure that isolates the relative difficulty mice have with reaching performance criteria under reversal conditions, revealed a genome wide significant QTL on chromosome 7 (max LOD score = 8.73, p<0.05). A measure of premature responding akin to that implemented in the 5-choice serial reaction time task yielded a suggestive QTL on chromosome 17 (max LOD score = 9.14, p<0.1). Positional candidate genes were prioritized ( 2900076A07Rik, Wdr73 and Zscan2) based upon expression QTL data we collected in DO and CC mice and analyses using publicly available gene expression and phenotype databases. These findings may advance understanding of the genetics that drive impulsive behavior and enhance risk for substance use disorders.