Abstract We are now entering a new era in protein sequence and structure annotation, with hundreds of millions of predicted protein structures made available through the AlphaFold database 1 . These models cover nearly all proteins that are known, including those challenging to annotate for function or putative biological role using standard homology-based approaches. In this study, we examine the extent to which the AlphaFold database has structurally illuminated this ‘dark matter’ of the natural protein universe at high predicted accuracy. We further describe the protein diversity that these models cover as an annotated interactive sequence similarity network, accessible at https://uniprot3d.org/atlas/AFDB90v4 . By searching for novelties from sequence, structure and semantic perspectives, we uncovered the β-flower fold, added several protein families to Pfam database 2 and experimentally demonstrated that one of these belongs to a new superfamily of translation-targeting toxin–antitoxin systems, TumE–TumA. This work underscores the value of large-scale efforts in identifying, annotating and prioritizing new protein families. By leveraging the recent deep learning revolution in protein bioinformatics, we can now shed light into uncharted areas of the protein universe at an unprecedented scale, paving the way to innovations in life sciences and biotechnology.

Bacteria have evolved sophisticated and diverse immunity mechanisms to protect themselves against a nearly constant onslaught of bacteriophages 1–3 . Similar to how eukaryotic innate immune systems sense foreign invaders through pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) 4 , many bacterial immune systems that respond to bacteriophage infection require a phage-specific trigger to be activated. However, the identities of such triggers and the mechanistic basis of sensing remain almost completely unknown. Here, we discover and investigate the anti-phage function of a fused toxin-antitoxin (TA) system called CapRel SJ46 that protects E. coli against diverse phages. Through genetic, biochemical, and structural analysis, we demonstrate that the C-terminal domain of CapRel SJ46 regulates the toxic N-terminal region, serving as both an antitoxin element and a phage-infection sensor. Following infection by certain phages, the newly synthesized major capsid protein binds directly to the C-terminal domain of CapRel SJ46 to relieve autoinhibition, enabling the toxin domain to then pyrophosphorylate tRNAs, which blocks translation to restrict viral infection. Collectively, our results reveal the molecular mechanism by which a bacterial immune system directly senses a conserved, essential component of phages, suggesting a PAMP-like sensing model for TA-mediated innate immunity in bacteria. We provide evidence that CapRels and their phage-encoded triggers are engaged in a Red Queen conflict 5 , revealing a new front in the intense coevolutionary battle being waged by phage and bacteria. With capsid proteins of some eukaryotic viruses known to stimulate innate immune signaling in mammalian hosts 6–10 , our results now reveal an ancient, deeply conserved facet of immunity.

Abstract Toxin-Antitoxin (TA) gene pairs are ubiquitous in microbial chromosomal genomes and plasmids, as well as bacteriophages. They act as regulatory switches, with the toxin limiting the growth of bacteria and archaea by compromising diverse essential cellular targets, and the antitoxin counteracting the toxic effect. To uncover previously uncharted TA diversity across microbes and bacteriophages, we analysed the conservation of genomic neighbourhoods using our computational tool FlaGs (for Fla nking G ene s ), which allows high-throughput detection of TA-like operons. Focussing on the widespread but poorly experimentally characterised antitoxin domain DUF4065, our in silico analyses indicated that DUF4065-containing proteins serve as broadly distributed antitoxin components in putative TA-like operons with dozens of different toxic domains with multiple different folds. Given the versatility of DUF4065, we have renamed the domain to Panacea (and proteins containing the domain, PanA) after the Greek goddess of universal remedy. We have experimentally validated nine PanA-neutralised TA pairs. While the majority of validated PanA-neutralised toxins act as translation inhibitors or membrane disruptors, a putative nucleotide cyclase toxin from a Burkholderia prophage compromises replication and translation, as well as inducing RelA-dependent accumulation of the nucleotide alarmone (p)ppGpp. We find that Panacea-containing antitoxins form a complex with their diverse cognate toxins, characteristic of the direct neutralisation mechanisms employed by Type II TA systems. Finally, through directed evolution we have selected PanA variants that can neutralise non-cognate TA toxins, thus experimentally demonstrating the evolutionary plasticity of this hyperpromiscuous antitoxin domain. Significance Toxin-antitoxin systems are enigmatic and diverse elements of bacterial and bacteriophage genomes. We have uncovered remarkable versatility of an antitoxin protein domain, that has evolved to neutralise dozens of different toxin domains. We find that antitoxins carrying this domain – Panacea – form complexes with their cognate toxins, indicating a direct neutralisation mechanism, and that Panacea can be evolved to neutralise a non-cognate and non-homologous toxin with just two amino acid substitutions. This raises the possibility that this domain could be an adaptable universal, or semi-universal protein neutraliser with significant biotechnological and medical potential.

Summary RelA-SpoT Homolog (RSH) enzymes control bacterial physiology through synthesis and degradation of the nucleotide alarmone (p)ppGpp. We recently discovered multiple families of Small Alarmone Synthetase (SAS) RSH acting as toxins of toxin-antitoxin (TA) modules, with the FaRel subfamily of toxSAS abrogating bacterial growth by producing an analogue of (p)ppGpp, (pp)pApp. Here we probe the mechanism of growth arrest employed by four experimentally unexplored subfamilies of toxSAS: FaRel2, PhRel, PhRel2 and CapRel. Surprisingly, all these toxins specifically inhibit protein synthesis. To do so, they transfer a pyrophosphate moiety from ATP to the tRNA 3′ CCA. The modification inhibits both tRNA aminoacylation and the sensing of cellular amino acid starvation by the ribosome-associated RSH RelA. Conversely, we show that some Small Alarmone Hydrolase (SAH) RSH enzymes can reverse the pyrophosphorylation of tRNA to counter the growth inhibition by toxSAS. Collectively, we establish RSHs as a novel class of RNA-modifying enzymes.

Toxin-antitoxins (TAs) are prokaryotic two-gene systems composed of a toxin neutralized by an antitoxin. Toxin-antitoxin-chaperone (TAC) systems additionally include a SecB-like chaperone that stabilizes the antitoxin by recognizing its chaperone addiction (ChAD) element. TACs mediate antiphage defense, but the mechanisms of viral sensing and restriction are unexplored. We identify two Escherichia coli antiphage TAC systems containing host inhibition of growth (HigBA) and CmdTA TA modules, HigBAC and CmdTAC. HigBAC is triggered through recognition of the gpV major tail protein of phage λ. Chaperone HigC recognizes gpV and ChAD via analogous aromatic molecular patterns, with gpV outcompeting ChAD to trigger toxicity. For CmdTAC, the CmdT ADP-ribosyltransferase toxin modifies mRNA to halt protein synthesis and limit phage propagation. Finally, we establish the modularity of TACs by creating a hybrid broad-spectrum antiphage system combining the CmdTA TA warhead with a HigC chaperone phage sensor. Collectively, these findings reveal the potential of TAC systems in broad-spectrum antiphage defense.

Abstract Listeriosis is a dangerous food-borne bacterial disease caused by the Gram-positive Bacillota (Firmicute) bacterium Listeria monocytogenes. In this report, we show that the synthetic lincosamide iboxamycin is highly active against L. monocytogenes and can overcome the intrinsic lincosamide resistance mediated by VgaL/Lmo0919, a member of ABCF ATPase resistance determinants that act by directly removing the antibiotic from the ribosome. While iboxamycin is not bactericidal against L. monocytogenes, it displays a pronounced postantibiotic effect, which is a valuable pharmacokinetic feature. Experiments in L. monocytogenes infection models are necessary to further assess the potential of iboxamycin as a novel drug for treatment of listeriosis. We demonstrate that VmlR ARE ABCF of Bacillota bacterium Bacillus subtilis grants significant (33-fold increase in MIC) protection from iboxamycin, while LsaA ABCF of Enterococcus faecalis grants an 8-fold protective effect. Furthermore, the VmlR-mediated iboxamycin resistance is cooperative with that mediated by the Cfr 23S rRNA methyltransferase resistance determinant, resulting in up to a 512-fold increase in MIC. Therefore, emergence and spread of ABCF ARE variants capable of defeating next-generation lincosamides in the clinic is possible and should be closely monitored.

Toxin-antitoxin (TA) systems are a large group of small genetic modules found in prokaryotes and their mobile genetic elements. Type II TAs are encoded as bicistronic (two-gene) operons that encode two proteins: a toxin and neutralising antitoxin. Using our tool NetFlax (standing for Network-FlaGs for toxins and antitoxins) we have performed a large-scale bioinformatic analysis of proteinaceous TAs, revealing interconnected clusters constituting a core network of TA-like gene pairs. To understand the structural basis of toxin neutralisation by antitoxins, we have predicted the structures of 3,419 complexes with AlphaFold2. Together with mutagenesis and functional assays, our structural predictions provide insights into the neutralising mechanism of the hyperpromiscuous Panacea antitoxin domain. In antitoxins composed of standalone Panacea, the domain mediates direct toxin neutralisation, while in multidomain antitoxins the neutralisation is mediated by other domains, such as PAD1, Phd-C and ZFD. We hypothesise that Panacea acts as a sensor that regulates TA activation. We have experimentally validated 16 new NetFlax TA systems. We used functional domain annotations and with metabolic labelling assays to predict their potential mechanisms of toxicity (such as disruption of membrane integrity, inhibition of cell division and abrogation of protein synthesis) as well as biological functions (such as antiphage defence). The interactive version of the NetFlax TA network that includes structural predictions can be accessed at http://netflax.webflags.se/.

Cell-free translational systems based on cellular lysates optimized for in vitro protein synthesis have multiple applications both in basic and applied science, ranging from studies of translation regulation to cell-free production of proteins and ribosome-nascent chain complexes. In order to achieve both high activity and reproducibility in a translational system, it is essential that the ribosomes in the cellular lysate are enzymatically active. Here we demonstrate that genomic disruption of genes encoding ribosome inactivating factors - HPF in Bacillus subtilis and Stm1 in Saccharomyces cerevisiae - robustly improve the activities of bacterial and yeast translational systems. A possible next step in developing strains for production of even more efficient cell-free translation systems could be achieved by combining a genomic disruption of the ribosome hibernation machinery with inactivation of the genes responsible for proteolysis and RNA degradation.

Summary Toxin-antitoxins (TAs) are prokaryotic two-gene systems comprised of a toxin neutralised by an antitoxin. Toxin-antitoxin-chaperone (TAC) systems additionally include a SecB-like chaperone that stabilises the antitoxin by recognising its chaperone addiction (ChAD) element. TACs have been shown to mediate antiphage defence, but the mechanisms of viral sensing and restriction are unexplored. We identify and characterise two Escherichia coli antiphage TAC systems containing HigBA and CmdTA TA units, HigBAC and CmdTAC. The HigBAC is triggered through recognition of the gpV major tail protein of phage λ. Both the ChAD and gpV are recognised by the HigC chaperone through analogous aromatic molecular patterns, explaining the mechanism of activation. We show that the CmdT ADP-ribosyltransferase toxin modifies mRNA to shut down protein synthesis. We establish the modularity of TACs by creating a hybrid broad-spectrum antiphage system combining the CmdTA TA warhead with the HigC chaperone phage sensor. Highlights E. coli HigBAC and CmdTAC are translation-targeting phage immunity TAC systems HigC chaperone recognises phage λ major tail protein to trigger HigBAC toxicity CmdT ADP-ribosyltransferase toxin abrogates translation through modification of mRNA HigC combined with CmdTA yields hybrid broad-spectrum antiphage defence system

Abstract Driven by the development and upscaling of fast genome sequencing and assembly pipelines, the number of protein-coding sequences deposited in public protein sequence databases is increasing exponentially. Recently, the dramatic success of deep learning-based approaches applied to protein structure prediction has done the same for protein structures. We are now entering a new era in protein sequence and structure annotation, with hundreds of millions of predicted protein structures made available through the AlphaFold database. These models cover most of the catalogued natural proteins, including those difficult to annotate for function or putative biological role based on standard, homology-based approaches. In this work, we quantified how much of such “dark matter” of the natural protein universe was structurally illuminated by AlphaFold2 and modelled this diversity as an interactive sequence similarity network that can be navigated at https://uniprot3d.org/atlas/AFDB90v4 . In the process, we discovered multiple novel protein families by searching for novelties from sequence, structure, and semantic perspectives. We added a number of them to Pfam, and experimentally demonstrate that one of these belongs to a novel superfamily of translation-targeting toxin-antitoxin systems, TumE-TumA. This work highlights the role of large-scale, evolution-driven protein comparison efforts in combination with structural similarities, genomic context conservation, and deep-learning based function prediction tools for the identification of novel protein families, aiding not only annotation and classification efforts but also the curation and prioritisation of target proteins for experimental characterisation.