Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems provide adaptive immunity against viruses and plasmids in bacteria and archaea. The silencing of invading nucleic acids is executed by ribonucleoprotein complexes preloaded with small, interfering CRISPR RNAs (crRNAs) that act as guides for targeting and degradation of foreign nucleic acid. Here, we demonstrate that the Cas9–crRNA complex of the Streptococcus thermophilus CRISPR3/Cas system introduces in vitro a double-strand break at a specific site in DNA containing a sequence complementary to crRNA. DNA cleavage is executed by Cas9, which uses two distinct active sites, RuvC and HNH, to generate site-specific nicks on opposite DNA strands. Results demonstrate that the Cas9–crRNA complex functions as an RNA-guided endonuclease with RNA-directed target sequence recognition and protein-mediated DNA cleavage. These findings pave the way for engineering of universal programmable RNA-guided DNA endonucleases.

The CRISPR/Cas adaptive immune system provides resistance against phages and plasmids in Archaea and Bacteria.CRISPR loci integrate short DNA sequences from invading genetic elements that provide small RNA-mediated interference in subsequent exposure to matching nucleic acids.In Streptococcus thermophilus, it was previously shown that the CRISPR1/Cas system can provide adaptive immunity against phages and plasmids by integrating novel spacers following exposure to these foreign genetic elements that subsequently direct the specific cleavage of invasive homologous DNA sequences.Here, we show that the S. thermophilus CRISPR3/Cas system can be transferred into Escherichia coli and provide heterologous protection against plasmid transformation and phage infection.We show that interference is sequence-specific, and that mutations in the vicinity or within the proto-spacer adjacent motif (PAM) allow plasmids to escape CRISPR-encoded immunity.We also establish that cas9 is the sole cas gene necessary for CRISPR-encoded interference.Furthermore, mutation analysis revealed that interference relies on the Cas9 McrA/HNH-and RuvC/RNaseH-motifs.Altogether, our results show that active CRISPR/Cas systems can be transferred across distant genera and provide heterologous interference against invasive nucleic acids.This can be leveraged to develop strains more robust against phage attack, and safer organisms less likely to uptake and disseminate plasmid-encoded undesirable genetic elements.

Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems protect bacteria and archaea from infection by viruses and plasmids. Central to this defense is a ribonucleoprotein complex that produces RNA-guided cleavage of foreign nucleic acids. In DNA-targeting CRISPR-Cas systems, the RNA component of the complex encodes target recognition by forming a site-specific hybrid (R-loop) with its complement (protospacer) on an invading DNA while displacing the noncomplementary strand. Subsequently, the R-loop structure triggers DNA degradation. Although these reactions have been reconstituted, the exact mechanism of R-loop formation has not been fully resolved. Here, we use single-molecule DNA supercoiling to directly observe and quantify the dynamics of torque-dependent R-loop formation and dissociation for both Cascade- and Cas9-based CRISPR-Cas systems. We find that the protospacer adjacent motif (PAM) affects primarily the R-loop association rates, whereas protospacer elements distal to the PAM affect primarily R-loop stability. Furthermore, Cascade has higher torque stability than Cas9 by using a conformational locking step. Our data provide direct evidence for directional R-loop formation, starting from PAM recognition and expanding toward the distal protospacer end. Moreover, we introduce DNA supercoiling as a quantitative tool to explore the sequence requirements and promiscuities of orthogonal CRISPR-Cas systems in rapidly emerging gene-targeting applications.

Article22 February 2011free access Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system Tomas Sinkunas Tomas Sinkunas Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Giedrius Gasiunas Giedrius Gasiunas Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Christophe Fremaux Christophe Fremaux Danisco France SAS, Dangé-Saint-Romain, France Search for more papers by this author Rodolphe Barrangou Rodolphe Barrangou Danisco USA Inc., Madison, WI, USA Search for more papers by this author Philippe Horvath Philippe Horvath Danisco France SAS, Dangé-Saint-Romain, France Search for more papers by this author Virginijus Siksnys Corresponding Author Virginijus Siksnys Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Tomas Sinkunas Tomas Sinkunas Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Giedrius Gasiunas Giedrius Gasiunas Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Christophe Fremaux Christophe Fremaux Danisco France SAS, Dangé-Saint-Romain, France Search for more papers by this author Rodolphe Barrangou Rodolphe Barrangou Danisco USA Inc., Madison, WI, USA Search for more papers by this author Philippe Horvath Philippe Horvath Danisco France SAS, Dangé-Saint-Romain, France Search for more papers by this author Virginijus Siksnys Corresponding Author Virginijus Siksnys Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania Search for more papers by this author Author Information Tomas Sinkunas1, Giedrius Gasiunas1, Christophe Fremaux2, Rodolphe Barrangou3, Philippe Horvath2 and Virginijus Siksnys 1 1Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania 2Danisco France SAS, Dangé-Saint-Romain, France 3Danisco USA Inc., Madison, WI, USA *Corresponding author. Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Graiciuno 8, Vilnius 02241, Lithuania. Tel.: +370 5 2602108; Fax: +370 5 2602116; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2011)30:1335-1342https://doi.org/10.1038/emboj.2011.41 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) is a recently discovered adaptive prokaryotic immune system that provides acquired immunity against foreign nucleic acids by utilizing small guide crRNAs (CRISPR RNAs) to interfere with invading viruses and plasmids. In Escherichia coli, Cas3 is essential for crRNA-guided interference with virus proliferation. Cas3 contains N-terminal HD phosphohydrolase and C-terminal Superfamily 2 (SF2) helicase domains. Here, we provide the first report of the cloning, expression, purification and in vitro functional analysis of the Cas3 protein of the Streptococcus thermophilus CRISPR4 (Ecoli subtype) system. Cas3 possesses a single-stranded DNA (ssDNA)-stimulated ATPase activity, which is coupled to unwinding of DNA/DNA and RNA/DNA duplexes. Cas3 also shows ATP-independent nuclease activity located in the HD domain with a preference for ssDNA substrates. To dissect the contribution of individual domains, Cas3 separation-of-function mutants (ATPase+/nuclease− and ATPase−/nuclease+) were obtained by site-directed mutagenesis. We propose that the Cas3 ATPase/helicase domain acts as a motor protein, which assists delivery of the nuclease activity to Cascade–crRNA complex targeting foreign DNA. Introduction Viruses have a major influence on all types of cellular life including eukaryotes, bacteria and archaea. To protect themselves against infection, prokaryotes have developed multiple defence barriers of various complexity, including prevention of adsorption, blocking of injection or degradation of the foreign nucleic acid (Sturino and Klaenhammer, 2006; Labrie et al, 2010). Recently, an adaptive microbial immune system, named clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs), has been identified that provides acquired immunity against viruses and plasmids (Barrangou et al, 2007). It consists of an array of short conserved DNA-repeat sequences that are interspaced by stretches of variable sequence called spacers, which generally originate from phage or plasmid DNA (Bolotin et al, 2005; Mojica et al, 2005). A set of cas (CRISPR-associated) genes is typically located in the vicinity to repeat-spacer array (Jansen et al, 2002; Makarova et al, 2006). CRISPR, in combination with the associated Cas proteins, forms the CRISPR/Cas systems, which are currently grouped into eight subtypes on the basis of clustering of cas genes (Haft et al, 2005; Makarova et al, 2006). It was shown in Streptococcus thermophilus that during natural generation of phage-resistant variants, bacteria commonly alter their CRISPR loci by polarized incorporation of novel spacers, which originate from the phages used in the challenge (Barrangou et al, 2007; Deveau et al, 2008; Horvath et al, 2008). Mechanistically, the function of the CRISPR system has been dissected into two distinct steps: (i) CRISPR adaptation (immunization), which includes the recognition of foreign DNA followed by its subsequent processing and integration into the host chromosomal CRISPR locus and (ii) interference (immunity), which includes transcription of the CRISPR locus and generation of crRNAs that serve as the guide sequences in the binding and/or degradation of the target nucleic acid (Sorek et al, 2008; Hale et al, 2009; van der Oost et al, 2009; Horvath and Barrangou, 2010; Karginov and Hannon, 2010). The molecular mechanism by which CRISPR provides resistance against foreign genetic elements is yet to be characterized. The first mechanistic details on the interference (immunity) step (Brouns et al, 2008) were obtained in experimental studies of the CRISPR/Cas system in Escherichia coli. E. coli K-12 strain possesses a single cluster of cas genes (Ecoli subtype) encoding eight proteins: three core proteins, Cas1, Cas2 and Cas3, and a subtype-specific five-protein set, Cse1–Cse2–Cse4–Cas5e–Cse3. The latter proteins are also referred to as CasABCDE and constitute a so-called Cascade complex. It was demonstrated (Brouns et al, 2008) in E. coli K-12 strain that the CRISPR region is transcribed into a long transcript (termed pre-crRNA), which is processed by the Cascade complex into small crRNAs, which contain a single spacer flanked on both sides by short nucleotide stretches originating from the repeat. These crRNA bound to the Cascade complex serve as the guide sequences that target foreign DNA and result in the CRISPR interference, presumably through the binding and/or degradation of the target nucleic acid. In E. coli, the Cascade complex alone is able to generate crRNA but requires Cas3 to achieve immunity against foreign DNA (Brouns et al, 2008). Hence, Cas3 appears to be a key protein of CRISPR system, which is necessary for crRNA-guided interference of virus proliferation. Moreover, cas3 is present in most CRISPR/Cas subtypes (except Nmeni and Mtube) (Haft et al, 2005; Makarova et al, 2006) but the mechanism by which Cas3 achieves its function is not yet known. In silico analysis predicts that cas3 encodes a polypeptide comprised of HD-type phosphohydrolase/nuclease and DExD/H-box helicase domains (Haft et al, 2005; Makarova et al, 2006); however, so far there is no experimental evidence to demonstrate its role in vitro. Detailed mechanistic and structural studies of Cas3 have been limited, in part, by the lack of a suitable model system for carrying out quantitative biochemical and structural studies in vitro. Due to its poor solubility and aggregation, the E. coli Cas3 protein can only be expressed in a very limited amount (Gasiunas and Siksnys, unpublished data). The HD-type nuclease subunit of the related Sulfolobus solfataricus Cas3 protein has recently been expressed in a soluble form as a fusion protein and demonstrated to catalyse hydrolysis of double-stranded (ds)DNA and RNA, although no experimental details are yet available on the activity of the putative helicase domain (Han and Krauss, 2009). In this paper, we provide the first biochemical characterization of the Cas3 protein identified in the CRISPR4 system of S. thermophilus DGCC7710. The latter CRISPR system belongs to the Ecoli subtype and comprises eight genes arranged similarly to the CRISPR system of E. coli (Horvath and Barrangou, 2010) (Figure 1A). We have cloned and expressed the cas3 gene of S. thermophilus DGCC7710 in E. coli ER2267, and purified the Cas3 protein to an apparent homogeneity. Here, we provide the first direct experimental evidence that Cas3 is a multifunctional protein possessing single-stranded DNA (ssDNA)-stimulated ATPase, ATP-dependent helicase and a metal-dependent single-stranded nuclease activities. Figure 1.(A) Schematic organization of the CRISPR4/Cas system of S. thermophilus DGCC7710 and the CRISPR/Cas system of E. coli K-12. Percentage of identical and similar (in parenthesis) residues between corresponding protein sequences that are connected by dashed lines. Conserved repeat sequences of each system are shown in the inserts. (B) Domain architecture of the S. thermophilus Cas3 protein. Domains identified by in silico analysis are shown as grey boxes. HD domain denotes HD-type phosphohydrolase/nuclease domain; DExD/H domain denotes DExD/H-box helicase domain; HelC dom denotes the C-terminal helicase domain. Conserved residues characteristic of the different domains and subject to alanine mutagenesis are indicated above the boxes. Location of the conserved helicase motifs are indicated by numbers I, II and VI. Download figure Download PowerPoint Results Expression and purification of Cas3 protein According to the genomic sequence of S. thermophilus DGCC7710, the cas3 gene of the CRISPR4/Cas system encodes a protein of 926 amino acids with a predicted molecular mass of ∼106 kDa. The sequence data have been submitted to the GenBank database under accession No. HQ453272. In silico analysis of Cas3 protein reveals a multidomain architecture (Figure 1B). The N-terminal part of Cas3 shows conserved residues characteristic of the HD family of metal-dependent phosphohydrolases (HD domain) (Aravind and Koonin, 1998), whereas the C-terminal part of Cas3 has motifs characteristic of the Superfamily 2 (SF2) helicases (Singleton et al, 2007). A BLAST search revealed that the Cas3 protein from S. thermophilus DGCC7710 shows ∼22% identity and ∼60% similarity at the amino-acid level to the Cas3 protein of E. coli K-12 (Figure 1). The cas3 gene from S. thermophilus DGCC7710 was cloned into the pBAD24-C(His)6 plasmid to yield a construct encoding a fusion protein containing a C-terminal 6-His-tag. The recombinant plasmid was expressed in the E. coli strain ER2267 and the Cas3 protein purified from the crude cell extracts. The purified Cas3 protein was ∼95% homogeneous as evaluated by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) and Coomassie Blue staining (Supplementary Figure S2). Typically, ∼12 mg of protein was obtained in a single run from 1 l of E. coli culture. Cas3 shows an ssDNA-stimulated ATPase activity The presence of the characteristic helicase motifs (I, II and VI) responsible for ATP binding and hydrolysis in the primary sequence of Cas3 predicts that the protein would be an ATPase. The ability of Cas3 to hydrolyze ATP was first examined by monitoring the hydrolysis of radioactively labelled [α32P]ATP (Figure 2A). In the presence of the Cas3 protein alone, only minimal ATPase activity was detected. However, the ATP hydrolysis rate increased significantly in the presence of M13 circular ssDNA. We further investigated the ATP hydrolysis by Cas3 in the presence of ssDNA, dsDNA and RNA by measuring the concentration of accumulated phosphate product using a colorimetric assay (Hyun et al, 2008). Data analysis revealed that ATPase activity of Cas3 increased significantly in the presence of ssDNA but was not stimulated by the dsDNA or by RNA (Figure 2B). The linear accumulation of inorganic phosphate as a function of time (representative trace shown in Figure 2C) allowed us to calculate the rate of ATP hydrolysis at 0.5 mM of ATP as ∼38 min−1. Taken together, these results indicate that Cas3 possesses an ssDNA-dependent ATPase activity. Figure 2.Cas3 ATPase activity. (A) Radioactive ATPase assay. ATPase reactions were conducted at 30°C in a reaction buffer containing 10 mM Tris–HCl (pH 7.5 at 25°C), 30 mM KCl, 5% (v/v) glycerol, 2 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA, 0.5 mM ATP, 2.5 nM ssDNA (M13mp18) or dsDNA (supercoiled form of pUC57 plasmid), and 250 nM Cas3. Reaction mixtures were supplemented with [α32P]ATP (5 Ci/mmol), spotted onto a polyethyleneimine-cellulose thin-layer plate and separated by chromatography followed by phosphorimager visualization. (B) ATP hydrolysis dependence of nucleic acids. Malachite green assay was used to measure ATP hydrolysis through the detection of liberated-free phosphate from ATP. Reaction mixtures in the buffer described above contained varying amounts of ssDNA (M13mp18), dsDNA (supercoiled form of pUC57 plasmid) or 2223 nt RNA. (C) Time courses of ATP hydrolysis. Reaction mixtures contained 3 nM ssDNA (M13mp18). Malachite green assay was used to measure ATP hydrolysis through the detection of liberated-free phosphate from ATP. (D) ATP hydrolysis rates. Reaction rate constant k (min−1) calculated from slopes of times courses shown in (C). Download figure Download PowerPoint To test whether the conserved residues of the helicase domain are important for the Cas3 ATPase activity, we generated a set of alanine-substitution mutants. We mutated amino-acid residues Q290A (located in Q-motif (Tanner et al, 2003) important for ATP binding), K316A (located in motif I involved in ATP binding), D452A and E453A (located in motif II involved in Mg2+ coordination at the ATPase active site), R663A and R666A (located in motif VI (Tanner and Linder, 2001) involved in ATP binding). As illustrated in Figure 2D, the ATPase activity of the mutants decreased significantly, indicating the importance of the conserved amino-acid residues for the ATP binding/hydrolysis. Conversely, mutations in the N-terminal HD domain had no effect on the ATPase activity of Cas3. In order to test the nucleotide specificity of Cas3, we compared the catalytic activity using ribo- and deoxyribonucleotide cofactors (Supplementary Figure S3). Cas3 exhibited a strong preference towards ATP or dATP. We also found that GTP and dGTP could be hydrolyzed in the presence of ssDNA, but with specific activities that were approximately 10-fold lower than observed with ATP. No significant hydrolytic activity was observed with other nucleotides. Study of the divalent metal ion dependence of the Cas3 ATPase activity revealed that the fastest rate was observed with Mn2+, followed closely by Mg2+ or Ca2+. Cu2+ supported hydrolysis at a much lower rate. No significant ATPase activity above background was observed using Co2+, Zn2+ or Ni2+ (Supplementary Figure S4). Cas3 shows nuclease activity located in the HD domain The nuclease activity of Cas3 was analysed using circular M13mp18 ssDNA or pUC57 supercoiled double-stranded plasmid DNA (Figure 3). Cas3 degraded the M13mp18 ssDNA in a concentration- and time-dependent manner (Figure 3; Supplementary Figure S5). In contrast, virtually no hydrolysis of the dsDNA occurred during the 2-h incubation. Mg2+ ions but not ATP were required for the ssDNA hydrolysis. Indeed, ssDNA was degraded with similar rates both in the absence or in the presence of ATP (data not shown). Figure 3.Cas3 nuclease activity. (A) Degradation of the ssDNA and dsDNA. Various amounts of Cas3 were incubated in the presence of 4 nM of M13 ssDNA or pUC57 dsDNA at 37°C for 2 h in the presence (+) or absence (−) of 10 mM MgCl2 or 10 mM EDTA. (B) Effect of mutations on Cas3 nuclease activity. In all, 500 nM of protein was incubated in the presence of 4 nM of M13 ssDNA at 37°C for 2 h. Download figure Download PowerPoint Conserved amino-acid residues H27, H76, D77 and D276 located in the N-terminal HD-like domain (Aravind and Koonin, 1998) of Cas3 (Figure 1B; Supplementary Figure S1) were identified as being part of the putative active site responsible for divalent metal binding and ssDNA hydrolysis. Alanine replacement mutants D77A and D227A were constructed by site-directed mutagenesis, mutant proteins were purified and their ability to degrade DNA was analysed (Figure 3B). Experimental data indicate that while ssDNA was fully degraded in 2 h by the wild type (wt) Cas3, ssDNA hydrolysis was significantly reduced for D77A and D227A. Mutations in the helicase domain had much weaker effects on the associated nuclease activity (Figure 3B). Cas3 shows DNA unwinding activity An ssDNA-dependent ATPase activity of Cas3 suggests a possible translocase/helicase function. To analyse whether the purified Cas3 protein possesses true helicase activity (i.e. DNA strand separation), we determined its capacity to unwind duplex DNA substrates (Figure 4). Since many helicases require a stretch of ssDNA in order to load onto the substrate and since Cas3 ATPase activity is stimulated by ssDNA, the substrate was constructed by hybridizing a 20-nt oligodeoxynucleotide, labelled with 32P at its 5′-terminus, to a circular M13mp18 ssDNA that contained a complementary sequence (Matson, 1986) (Figure 4A). This substrate was incubated with Cas3 and the reaction products were separated on a polyacrylamide gel. The labelled oligonucleotide was then detected by autoradiography. The experimental results indicate (Figure 4B) that Cas3 possesses a DNA unwinding activity that is dependent upon the presence of both Mg2+ and ATP but is not supported in the presence of the non-hydrolysable ATP analogue 5′-adenylyl-β, γ-imidodiphosphate (AMP-PNP). Furthermore, the Cas3 nuclease-deficient mutant D77A unwound the DNA similarly to the wt protein while the D452A mutant, which has compromised ATPase activity, showed no unwinding activity. Figure 4.Cas3 helicase activity and polarity. (A). Schematic representation of duplex unwinding assay. (B, C) DNA–DNA and RNA–DNA duplex unwinding by Cas3. Cas3 displacement of a P32-labelled 20 nt oligodeoxynucleotide (B) or 22 oligoribonucleotide (C) annealed to an ssM13mp18 DNA is monitored in the polyacrylamide gel. Reactions were performed at 30°C for 1 h in the reaction buffer: 10 mM Tris–HCl (pH 7.5 at 25°C), 25 mM KCl, 15% (v/v) glycerol, 1 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 0.5 nM substrate and various amounts of protein. nA denotes the ATP analogue AMP-PNP. D452A and D77A are ATPase and nuclease domain mutants, respectively. (D) Cas3 polarity assay I. Cas3 displacement of 30 nt double-stranded fragments at the ends of the linear M13mp18 DNA. Partial duplex DNA was prepared by EheI cleavage of the labelled 60 nt oligodeoxynucleotide annealed to the M13pm18 DNA. Duplex regions are separated by a single-stranded region of few thousand nucleotides. Reaction mixture contained 500 nM of Cas3. Reactions were stopped at defined time intervals. (E) Cas3 polarity assay II. Cas3 displacement of the oligonucleotide-based 73 nt substrates containing 53 nt 3′- or 5′-overhangs. Reactions were performed as in Figure 4B and C except that with the oligonucleotide-based substrates 500 nM of Cas3, 1.5 nM of substrate and 250 nM trap DNA (unlabelled oligonucleotide) were used in the reaction. Download figure Download PowerPoint To test whether the Cas3 protein unwinds an RNA/DNA heteroduplex, a substrate was constructed by hybridizing a 22-nt oligoribonucleotide to M13mp18 ssDNA as mentioned above. The experimental results indicate (Figure 4C) that Cas3 displaces the 22-nt oligoribonucleotide in the presence of ATP and Mg2+ ions. Thus, Cas3 can be classified as both a DNA–DNA and DNA–RNA helicase. With partially duplex substrates, each DNA helicase is thought to bind first to an ssDNA region and then to approach and unwind duplex DNA in a particular direction. To determine the directionality of Cas3, we first prepared a pair of labelled helicase substrates (Figure 4D) that contained duplex DNA at both ends of a long linear ssDNA molecule. Since the substrates comprise duplex regions at both ends of a long linear molecule, Cas3 must first bind to the internal single-stranded regions of these substrates. If the enzyme subsequently moves into a 3′–5′ direction along the ssDNA segment, it would displace the 5′-labelled fragment from the substrate. In contrast, the 3′-labelled fragment would be displaced if the enzyme migrates in a 5′–3′ direction. Experimental data presented in Figure 4 indicate that Cas3 moves primarily 3′ to 5′ along the ssDNA segment. We also performed an alternative unwinding assay using radiolabelled DNA substrates of different structures. These 73 nt partial oligoduplexes contained 53 nt 3′- or 5′-single-stranded overhangs in addition to a 20-bp duplex region (Figure 4E). Cas3 could only unwind the substrates containing a 3′-overhang, confirming the 3′–5′ polarity seen above. The unwinding activity of Cas3 was observed in the presence of ATP and was not detected in the absence of ATP or in the presence of the non-hydrolyzable ATP analogue (AMP-PNP), suggesting that ATP hydrolysis is required for helicase function. Discussion cas3 is a core gene present in most of the CRISPR/Cas subtypes (except Nmeni and Mtube). The presence of the HD-type phosphohydrolase/nuclease domain led to the proposal that Cas3 might catalyse crRNA-guided cleavage of foreign nucleic acids (van der Oost et al, 2009). Since Cas3 also carries an apparent ATP/helicase domain, it was suggested (Marraffini and Sontheimer, 2010) that it could act also as a target DNA unwindase to enable protospacer hybridization with the crRNA. Here, we overproduced the Cas3 protein of a S. thermophilus CRISPR4/Cas system (Horvath and Barrangou, 2010), which belongs to the Ecoli subtype, purified Cas3 to ∼95% homogeneity, and performed functional characterization in vitro. Cas3 degrades ssDNA The Cas3 protein of S. thermophilus is arranged as a polypeptide comprised of an N-terminal HD-type phosphohydrolase/nuclease domain and a C-terminal SF2 helicase domain (Haft et al, 2005; Makarova et al, 2006). This architecture is characteristic of most Cas3 proteins but it is not absolutely conserved. For example, in the Cas3 protein of Apern subtype, the domains are found in swapped order, while in the Cas3 of Ypest, the HD-type phosphohydrolase/nuclease domain is found at the N-terminus of the cas2 gene (Brouns et al, 2008). In some cases, such as in S. solfataricus, the HD-type phosphohydrolase/nuclease and the DExD/H-box helicase domains are encoded as separate genes (Han et al, 2009). The HD-type phosphohydrolase/nuclease domain is found in a superfamily of enzymes with either a predicted or known phosphohydrolase activity (Aravind and Koonin, 1998). According to Prosite database, bacterial HD domains are found in combination of 49 different partner domains, which presumably modulate protein function. HD-domain-containing proteins appear to be involved in nucleic acid metabolism and signal transduction, as well as other unknown functions (Aravind and Koonin, 1998). For example, the HD domain of the E. coli tRNA nucleotidyltransferase exhibits 2,3-cyclic phosphodiesterase, 2-nucleotidase and phosphatase activities (Yakunin et al, 2004). The N-terminal domain of Cas3 contains a characteristic signature of the HD-type phosphohydrolase/nuclease domain (Figure 1B). The conserved residues (H…HD…D) predicted to be involved in the coordination of the divalent metal (Aravind and Koonin, 1998) are conserved in the N-terminal domain of S. thermophilus Cas3 and correspond to the residues H27, H76, D77 and D227. We show here that in the presence of magnesium ions, Cas3 has a nuclease activity that degrades ssDNA. It does not act on dsDNA (Figure 3). While Mg2+ ions are absolutely necessary for the nuclease activity, ATP is not. Mutation of the key metal-coordinating residues D77 and D227 compromised the ability of Cas3 to degrade ssDNA, but did not affect the ATPase activity, consistent with in silico predictions. The ssDNA-degrading activity of the S. thermophilus Cas3 protein is in contrast to the apparent dsDNA and dsRNA cleavage activity of the standalone HD phosphohydrolase/nuclease of S. solfataricus (Han and Krauss, 2009) with only minor degradation of ssDNA or ssRNA observed. It is not clear whether this represents a true difference between the CRISPR systems or whether the activity of the HD domain is altered when the helicase domain is present (even though helicase activity is not required). Cas3 unwinds DNA in the presence of ATP The C-terminal fragment of Cas3 protein carries signature motifs characteristic of the SF2 helicases of the DExD/H subgroup (Singleton et al, 2007). Helicases use ATP to unwind and translocate nucleic acids or remodel nucleic acids or nucleic acid–protein complexes (Cordin et al, 2006; Singleton et al, 2007; Fairman-Williams et al, 2010). We show here that the Cas3 protein exhibits ssDNA-dependent ATPase activity, which absolutely requires Mg2+ ions. Nine conserved domains Q, I, Ia, Ib and II–VI have been identified in the SF2 group of DExD/H-type helicases (Cordin et al, 2006; Singleton et al, 2007; Fairman-Williams et al, 2010). The highest level of sequence conservation in the SF1 and SF2 helicase families is seen in the residues that coordinate binding and hydrolysis of the triphosphate (motifs I, II and VI). Mutations of the amino-acid residues Q290, K316, D452, E453, R663 and R666 in the conserved motifs I, II and VI, abolished or significantly compromised ATP hydrolysis. However, none of the helicase mutants showed any change in the ssDNA-degrading activity. Among different deoxy- and ribonucleotides tested, only ATP or dATP were hydrolysed significantly (Supplementary Figure S3). The maximum rate of ATP hydrolysis was ∼38 molecules per minute (Figure 2D). This value is also close to the value reported for the bacterial XPB helicase (Biswas et al, 2009) and NS3 helicase from hepatitis C virus (Kyono et al, 2003). The inefficient ATP hydrolysis suggests that Cas3 alone is not very processive or that it is an intrinsically slow ATPase involved, for example, in the local remodelling of protein–crRNA complex (see below). In parallel to the ATPase activity, Cas3 protein is able to unwind oligonucleotide–M13 DNA complex. The unwinding activity of Cas3 is dependent on the protein concentration and presence of ATP and Mg2+ ions. Using a linear M13 molecule with a large internal region of ssDNA where a helicase can assemble, and two 32P-labelled duplex regions of different lengths, we show that Cas3 helicase has 3′ → 5′ directionality. It is likely that Cas3 functions as DNA translocase but translocation activity still has to be demonstrated directly. Cas3 contains a long C-terminal extension that follows the conserved helicase domains of the SF2 superfamily. Terminal domains of helicases have been demonstrated to direct recruitment of partner proteins/complexes, to promote interactions with other proteins, or to facilitate recognition of specific nucleic acid regions (Karow and Klostermeier, 2010). One cannot exclude that the C-terminal domain of Cas3 performs similar functions. Putative role of Cas3 in the CRISPR mechanism Taken together, our biochemical studies show that Cas3 protein combines in a single protein both ssDNA nuclease and ATPase/helicase activities. How can these activities be reconciled with the CRISPR mechanism? It was previously shown that in E. coli at least, a so-called Cascade complex consisting of the five protein set Cse1–Cse2–Cse4–Cas5e–Cse3 performs processing of a pre-crRNA into mature crRNAs, which remain associated with Cascade (Brouns et al, 2008). Hence, Cas3 is not required in the crRNA generation step and is probably involved in the CRISPR adaptation and/or interference steps. Indeed, in vivo studies demonstrate that both Cas3 and Cascade–crRNA complexes are required for the interference step (Brouns et al, 2008). We suggest that ATP-dependent DNA helicase activity of Cas3 can contribute both to the protospacer sequence recognition by the Cascade–crRNA complex and DNA cleavage (Figure 5). It is possible that Cascade–crRNA complex interactions with the target DNA promote strand separation and create ssDNA regions for the Cas3 binding, which further unwinds DNA strands promoting crRNA hybridization to the complementary protospacer DNA. Indeed, Cas3 ATPase activity, which is necessary for the strand displacement, is stimulated by ssDNA but not by dsDNA (Figure 2). Invasion of the crRNA into the DNA duplex should result in the formation of the R-loop structure (Camps and Loeb, 2005) and the ATP-dependent Cas3 helicase activity may promote the formation of such loops. On the other hand, in the R-loop structure, a single-stranded antisense DNA s

RNA-guided nucleases (RGNs) based on the type II CRISPR-Cas9 system of Streptococcus pyogenes (Sp) have been widely used for genome editing in experimental models. However, the nontrivial level of off-target activity reported in several human cells may hamper clinical translation. RGN specificity depends on both the guide RNA (gRNA) and the protospacer adjacent motif (PAM) recognized by the Cas9 protein. We hypothesized that more stringent PAM requirements reduce the occurrence of off-target mutagenesis. To test this postulation, we generated RGNs based on two Streptococcus thermophilus (St) Cas9 proteins, which recognize longer PAMs, and performed a side-by-side comparison of the three RGN systems targeted to matching sites in two endogenous human loci, PRKDC and CARD11. Our results demonstrate that in samples with comparable on-target cleavage activities, significantly lower off-target mutagenesis was detected using St-based RGNs as compared to the standard Sp-RGNs. Moreover, similarly to SpCas9, the StCas9 proteins accepted truncated gRNAs, suggesting that the specificities of St-based RGNs can be further improved. In conclusion, our results show that Cas9 proteins with longer or more restrictive PAM requirements provide a safe alternative to SpCas9-based RGNs and hence a valuable option for future human gene therapy applications. RNA-guided nucleases (RGNs) based on the type II CRISPR-Cas9 system of Streptococcus pyogenes (Sp) have been widely used for genome editing in experimental models. However, the nontrivial level of off-target activity reported in several human cells may hamper clinical translation. RGN specificity depends on both the guide RNA (gRNA) and the protospacer adjacent motif (PAM) recognized by the Cas9 protein. We hypothesized that more stringent PAM requirements reduce the occurrence of off-target mutagenesis. To test this postulation, we generated RGNs based on two Streptococcus thermophilus (St) Cas9 proteins, which recognize longer PAMs, and performed a side-by-side comparison of the three RGN systems targeted to matching sites in two endogenous human loci, PRKDC and CARD11. Our results demonstrate that in samples with comparable on-target cleavage activities, significantly lower off-target mutagenesis was detected using St-based RGNs as compared to the standard Sp-RGNs. Moreover, similarly to SpCas9, the StCas9 proteins accepted truncated gRNAs, suggesting that the specificities of St-based RGNs can be further improved. In conclusion, our results show that Cas9 proteins with longer or more restrictive PAM requirements provide a safe alternative to SpCas9-based RGNs and hence a valuable option for future human gene therapy applications.

The Cas9-crRNA complex of the Streptococcus thermophilus DGCC7710 CRISPR3-Cas system functions as an RNA-guided endonuclease with crRNA-directed target sequence recognition and protein-mediated DNA cleavage. We show here that an additional RNA molecule, tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA), co-purifies with the Cas9 protein isolated from the heterologous E. coli strain carrying the S. thermophilus DGCC7710 CRISPR3-Cas system. We provide experimental evidence that tracrRNA is required for Cas9-mediated DNA interference both in vitro and in vivo. We show that Cas9 specifically promotes duplex formation between the precursor crRNA (pre-crRNA) transcript and tracrRNA, in vitro. Furthermore, the housekeeping RNase III contributes to primary pre-crRNA-tracrRNA duplex cleavage for mature crRNA biogenesis. RNase III, however, is not required in the processing of a short pre-crRNA transcribed from a minimal CRISPR array containing a single spacer. Finally, we show that an in vitro-assembled ternary Cas9-crRNA-tracrRNA complex cleaves DNA. This study further specifies the molecular basis for crRNA-based re-programming of Cas9 to specifically cleave any target DNA sequence for precise genome surgery. The processes for crRNA maturation and effector complex assembly established here will contribute to the further development of the Cas9 re-programmable system for genome editing applications.

To expand the repertoire of Cas9s available for genome targeting, we present a new in vitro method for the simultaneous examination of guide RNA and protospacer adjacent motif (PAM) requirements. The method relies on the in vitro cleavage of plasmid libraries containing a randomized PAM as a function of Cas9-guide RNA complex concentration. Using this method, we accurately reproduce the canonical PAM preferences for Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus CRISPR3 (Sth3), and CRISPR1 (Sth1). Additionally, PAM and sgRNA solutions for a novel Cas9 protein from Brevibacillus laterosporus are provided by the assay and are demonstrated to support functional activity in vitro and in plants.

Age-dependent epigenetic changes that are influenced by genetic factors contribute to lactase nonpersistence, which is linked to the inability of adult mammals to digest lactose. The inability to digest lactose, due to lactase nonpersistence, is a common trait in adult mammals, except in certain human populations that exhibit lactase persistence. It is not known how the lactase gene is dramatically downregulated with age in most individuals but remains active in some individuals. We performed a comprehensive epigenetic study of human and mouse small intestines, by using chromosome-wide DNA-modification profiling and targeted bisulfite sequencing. Epigenetically controlled regulatory elements accounted for the differences in lactase mRNA levels among individuals, intestinal cell types and species. We confirmed the importance of these regulatory elements in modulating lactase mRNA levels by using CRISPR–Cas9-induced deletions. Genetic factors contribute to epigenetic changes occurring with age at the regulatory elements, because lactase-persistence and lactase-nonpersistence DNA haplotypes demonstrated markedly different epigenetic aging. Thus, genetic factors enable a gradual accumulation of epigenetic changes with age, thereby influencing phenotypic outcome.

ABSTRACT CRISPR-Cas9 nucleases are abundant in microbes. To explore this largely uncharacterized diversity, we applied cell-free biochemical screens to rapidly assess the protospacer adjacent motif (PAM) and guide RNA (gRNA) requirements of novel Cas9 proteins. This approach permitted the characterization of 79 Cas9 orthologs with at least 7 distinct classes of gRNAs and 50 different PAM sequence requirements. PAM recognition spanned the entire spectrum of T-, A-, C-, and G-rich nucleotides ranging from simple di-nucleotide recognition to complex sequence strings longer than 4. Computational analyses indicated that most of this diversity came from 4 groups of interrelated sequences providing new insight into Cas9 evolution and efforts to engineer PAM recognition. A subset of Cas9 orthologs were purified and their activities examined further exposing additional biochemical diversity. This constituted both narrow and broad ranges of temperature dependence, staggered-end DNA target cleavage, and a requirement for longer stretches of homology between gRNA and DNA target to function robustly. In all, the diverse collection of Cas9 orthologs presented here sheds light on Cas9 evolution and provides a rich source of PAM recognition and other potentially desirable properties that may be mined to expand the genome editing toolbox with new RNA-programmable nucleases.