Abstract Kinetochores are macromolecular protein complexes assembled on centromeric chromatin that ensure accurate chromosome segregation by linking DNA to spindle microtubules and integrating safeguard mechanisms. A kinetochore-associated pool of Ipl1 Aurora B kinase, a subunit of the chromosomal passenger complex (CPC), was previously implicated in feedback control mechanisms. To study the kinetochore subunit connectivity built on budding yeast point centromeres and its CPC interactions we performed crosslink-guided in vitro reconstitution. The Ame1/Okp1 CENP-U/Q heterodimer, forming the COMA complex with Ctf19/Mcm21 CENP-P/O , selectively bound Cse4 CENP-A nucleosomes through the Cse4 N-terminus and thereby establishes a direct link to the outer kinetochore MTW1 complex. The Sli15/Ipl1 INCENP/Aurora B core-CPC interacted with COMA through the Ctf19 C-terminus, and artificial tethering of Sli15 to Ame1/Okp1 rescued synthetic lethality upon Ctf19/Mcm21 deletion in a Sli15 centromere-targeting deficient mutant. This study reveals characteristics of the inner kinetochore architecture assembled at point centromeres and the relevance of its Sli15/Ipl1 interaction for CPC function.

Summary Meiotic recombination is triggered by programmed double-strand breaks (DSBs), a subset of these being repaired as crossovers, promoted by eight evolutionarily conserved proteins, named ZMM. Crossover formation is functionally linked to synaptonemal complex (SC) assembly between homologous chromosomes, but the underlying mechanism is unknown. Here we show that Ecm11, a SC central element protein, localizes on both DSB sites and sites that attach chromatin loops to the chromosome axis, which are the starting points of SC formation, in a way that strictly requires the ZMM protein Zip4. Furthermore, Zip4 directly interacts with Ecm11 and point mutants that specifically abolish this interaction lose Ecm11 binding to chromosomes and exhibit defective SC assembly. This can be partially rescued by artificially tethering interaction-defective Ecm11 to Zip4. Mechanistically, this direct connection ensuring SC assembly from CO sites could be a way for the meiotic cell to shut down further DSB formation once enough recombination sites have been selected for crossovers, thereby preventing excess crossovers. Finally, the mammalian ortholog of Zip4, TEX11, also interacts with the SC central element TEX12, suggesting a general mechanism.

Abstract Protein-RNA interactions play a critical role in many cellular processes and pathologies. However, experimental determination of protein-RNA structures is still challenging, therefore computational tools are needed for the prediction of protein-RNA interfaces. Although evolutionary pressures can be exploited for structural prediction of protein-protein interfaces, and recent deep learning methods using protein multiple sequence alignments have radically improved the performance of protein-protein interface structural prediction, protein-RNA structural prediction is lagging behind, due to the scarcity of structural data and the flexibility involved in these complexes. To study the evolution of protein-RNA interface structures, we first identified a large and diverse dataset of 2,022 pairs of structurally homologous interfaces (termed structural interologs). We leveraged this unique dataset to analyze the conservation of interface contacts among structural interologs based on the properties of involved amino acids and nucleotides. We uncovered that 73% of distance-based contacts and 68% of apolar contacts are conserved on average, and the strong conservation of these contacts occurs even in distant homologs with sequence identity below 20%. Distance-based contacts are also much more conserved compared to what we had found in a previous study of homologous protein-protein interfaces. In contrast, hydrogen bonds, salt bridges, and π-stacking interactions are very versatile in pairs of protein-RNA interologs, even for close homologs with high interface sequence identity. We found that almost half of the non-conserved distance-based contacts are due to a small proportion of interface residues that no longer belong to the interface in the interolog, a phenomenon we term “interface switching out”. We also examined possible recovery mechanisms for non-conserved hydrogen bonds and salt bridges, uncovering diverse scenarii of switching out, change in amino acid chemical nature, intermolecular and intramolecular compensations. Our findings provide insights for integrating evolutionary signals into predictive protein-RNA structural modeling methods.

Abstract Whereas our understanding of kinesin auto-inhibition mechanisms is improving faster, important insights into kinesin activation mechanisms such as those controlled by cargo-motor adaptors are still missing. JIP3 and JIP4 are versatile motor-cargo adaptors for kinesin1 and dynein-dynactin motors enabling bi-directional transport on microtubules. JIP3 activates kinesin1 heavy chains, independently of kinesin1 light chains. In this report, we characterize the molecular details of the binding of the kinesin1 heavy chain, Kif5b to the motor-cargo adaptors, JIP3 and JIP4, using biophysical approaches. The definition of the exact binding site of Kif5b, as well as the specificity of interaction between JIP3 and JIP4 provide new insights into kinesin1 activation.

Abstract CRISPR-Cas systems provide their prokaryotic hosts with adaptive immunity against mobile genetic elements. Many bacteriophages encode anti-CRISPR (Acr) proteins that inhibit host defense. The identification of Acr proteins is challenging due to their small size and high sequence diversity, and only a limited number has been characterized to date. In this study, we report the discovery of a novel Acr protein, AcrIB2, encoded by the φCD38-2 Clostridioides difficile phage that efficiently inhibits interference by the type I-B CRISPR-Cas system of the host and likely acts as a DNA mimic. Most C. difficile strains contain two cas operons, one encoding a full set of interference and adaptation proteins and another encoding interference proteins only. Unexpectedly, we show that only the partial operon is required for interference and is subject to inhibition by AcrIB2.

Abstract Genome and epigenome integrity in eukaryotes depends on the proper coupling of histone deposition with DNA synthesis. This process relies on the evolutionary conserved histone chaperone CAF-1 for which the links between structure and functions are still a puzzle. While studies of the S. cerevisiae CAF-1 complex enabled to propose a model for the histone deposition mechanism, we still lack a framework to demonstrate its generality and in particular, how its interaction with the polymerase accessory factor PCNA is operating. Here, we reconstituted a complete Sp CAF-1 from fission yeast. We characterized its dynamic structure using NMR, SAXS and molecular modeling together with in vitro and in vivo functional studies on rationally designed interaction mutants. Importantly, we identify the unfolded nature of the acidic domain which folds up when binding to histones. We also show how the long KER helix mediates DNA binding and stimulates Sp CAF-1 association with PCNA. Our study highlights how the organization of CAF-1 comprising both disordered regions and folded modules enables the dynamics of multiple interactions to promote synthesis-coupled histone deposition essential for its DNA replication, heterochromatin maintenance, and genome stability functions.

Protein-RNA interactions play a critical role in many cellular processes and pathologies. However, experimental determination of protein-RNA structures is still challenging, therefore computational tools are needed for the prediction of protein-RNA interfaces. Although evolutionary pressures can be exploited for structural prediction of protein-protein interfaces, and recent deep learning methods using protein multiple sequence alignments have radically improved the performance of protein-protein interface structural prediction, protein-RNA structural prediction is lagging behind, due to the scarcity of structural data and the flexibility involved in these complexes. To study the evolution of protein-RNA interface structures, we first identified a large and diverse dataset of 2,022 pairs of structurally homologous interfaces (termed structural interologs). We leveraged this unique dataset to analyze the conservation of interface contacts among structural interologs based on the properties of involved amino acids and nucleotides. We uncovered that 73% of distance-based contacts and 68% of apolar contacts are conserved on average, and the strong conservation of these contacts occurs even in distant homologs with sequence identity below 20%. Distance-based contacts are also much more conserved compared to what we had found in a previous study of homologous protein-protein interfaces. In contrast, hydrogen bonds, salt bridges, and π-stacking interactions are very versatile in pairs of protein-RNA interologs, even for close homologs with high interface sequence identity. We found that almost half of the non-conserved distance-based contacts are linked to a small proportion of interface residues that no longer make interface contacts in the interolog, a phenomenon we term “interface switching out”. We also examined possible recovery mechanisms for non-conserved hydrogen bonds and salt bridges, uncovering diverse scenarios of switching out, change in amino acid chemical nature, intermolecular and intramolecular compensations. Our findings provide insights for integrating evolutionary signals into predictive protein-RNA structural modeling methods.

Abstract The revolution brought about by AlphaFold2 and the performance of AlphaFold2-Multimer open promising perspectives to unravel the complexity of protein-protein interaction networks. Nevertheless, the analysis of interaction networks obtained from proteomics experiments does not systematically provide the delimitations of the interaction regions. This is of particular concern in the case of interactions mediated by intrinsically disordered regions, in which the interaction site is generally small. Using a dataset of protein-peptide complexes involving intrinsically disordered protein regions that are non-redundant with the structures used in AlphaFold2 training, we show that when using the full sequences of the proteins involved in the interaction networks, AlphaFold2-Multimer only achieves 40% success rate in identifying the correct site and structure of the interface. By delineating the interaction region into fragments of decreasing size and combining different strategies for integrating evolutionary information, we managed to raise this success rate up to 90%. Beyond the correct identification of the interaction site, our study also explores specificity issues. We show the advantages and limitations of using the AlphaFold2 confidence score to discriminate between alternative binding partners, a task that can be particularly challenging in the case of small interaction motifs.