Summary Norepinephrine (NE) is an essential biogenic monoamine neurotransmitter, yet researches using prototype NE sensors were limited by their low sensitivities. Here, we developed next-generation versions of GPCR activation-based NE sensors (GRAB NE2m and GRAB NE2h ) with a superior response, high sensitivity and selectivity to NE both in vitro and in vivo . Notably, these sensors can detect NE release triggered by either optogenetic or behavioral stimuli in freely moving mice, producing robust signals in the locus coeruleus and hypothalamus. With the development of a novel transgenic mouse line, we recorded both NE release and calcium dynamics with dual-color fiber photometry throughout the sleep-wake cycle; moreover, dual-color mesoscopic imaging revealed cell type‒specific spatiotemporal dynamics of NE and calcium during sensory processing and locomotion. Thus, these new GRAB NE sensors are valuable tools for monitoring the precise spatiotemporal release of NE in vivo , providing new insights into the physiological and pathophysiological roles of NE.

Dopamine (DA) plays multiple roles in a wide range of physiological and pathological processes via a vast network of dopaminergic projections. To fully dissect the spatiotemporal dynamics of DA release in both dense and sparsely innervated brain regions, we developed a series of green and red fluorescent GPCR activation-based DA (GRABDA) sensors using a variety of DA receptor subtypes. These sensors have high sensitivity, selectivity, and signal-to-noise properties with subsecond response kinetics and the ability to detect a wide range of DA concentrations. We then used these sensors in freely moving mice to measure both optogenetically evoked and behaviorally relevant DA release while measuring neurochemical signaling in the nucleus accumbens, amygdala, and cortex. Using these sensors, we also detected spatially resolved heterogeneous cortical DA release in mice performing various behaviors. These next-generation GRABDA sensors provide a robust set of tools for imaging dopaminergic activity under a variety of physiological and pathological conditions.