CRISPR-Cas9 nucleases are widely used for genome editing but can induce unwanted off-target mutations. Existing strategies for reducing genome-wide off-target effects of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) are imperfect, possessing only partial or unproven efficacies and other limitations that constrain their use. Here we describe SpCas9-HF1, a high-fidelity variant harbouring alterations designed to reduce non-specific DNA contacts. SpCas9-HF1 retains on-target activities comparable to wild-type SpCas9 with >85% of single-guide RNAs (sgRNAs) tested in human cells. Notably, with sgRNAs targeted to standard non-repetitive sequences, SpCas9-HF1 rendered all or nearly all off-target events undetectable by genome-wide break capture and targeted sequencing methods. Even for atypical, repetitive target sites, the vast majority of off-target mutations induced by wild-type SpCas9 were not detected with SpCas9-HF1. With its exceptional precision, SpCas9-HF1 provides an alternative to wild-type SpCas9 for research and therapeutic applications. More broadly, our results suggest a general strategy for optimizing genome-wide specificities of other CRISPR-RNA-guided nucleases.

Although CRISPR-Cas9 nucleases are widely used for genome editing, the range of sequences that Cas9 can recognize is constrained by the need for a specific protospacer adjacent motif (PAM). As a result, it can often be difficult to target double-stranded breaks (DSBs) with the precision that is necessary for various genome-editing applications. The ability to engineer Cas9 derivatives with purposefully altered PAM specificities would address this limitation. Here we show that the commonly used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) can be modified to recognize alternative PAM sequences using structural information, bacterial selection-based directed evolution, and combinatorial design. These altered PAM specificity variants enable robust editing of endogenous gene sites in zebrafish and human cells not currently targetable by wild-type SpCas9, and their genome-wide specificities are comparable to wild-type SpCas9 as judged by GUIDE-seq analysis. In addition, we identify and characterize another SpCas9 variant that exhibits improved specificity in human cells, possessing better discrimination against off-target sites with non-canonical NAG and NGA PAMs and/or mismatched spacers. We also find that two smaller-size Cas9 orthologues, Streptococcus thermophilus Cas9 (St1Cas9) and Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), function efficiently in the bacterial selection systems and in human cells, suggesting that our engineering strategies could be extended to Cas9s from other species. Our findings provide broadly useful SpCas9 variants and, more importantly, establish the feasibility of engineering a wide range of Cas9s with altered and improved PAM specificities.

A new engineered version of SpCas9, called HypaCas9, displays enhanced accuracy of editing without significant loss of efficiency at the desired target. One of the main concerns about the use of CRISPR in genomic editing is the possibility of 'off-target' events. Scientists have been modifying the central enzyme involved in CRISPR editing, Cas9 or its homologues, to reduce this unwanted property. Jennifer Doudna and colleagues describe a new version of this nuclease, HypaCas9, which enables more accurate editing, without substantial loss of efficiency on the desired target. The RNA-guided CRISPR–Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes (SpCas9) has been widely repurposed for genome editing1,2,3,4. High-fidelity (SpCas9-HF1) and enhanced specificity (eSpCas9(1.1)) variants exhibit substantially reduced off-target cleavage in human cells, but the mechanism of target discrimination and the potential to further improve fidelity are unknown5,6,7,8,9. Here, using single-molecule Förster resonance energy transfer experiments, we show that both SpCas9-HF1 and eSpCas9(1.1) are trapped in an inactive state10 when bound to mismatched targets. We find that a non-catalytic domain within Cas9, REC3, recognizes target complementarity and governs the HNH nuclease to regulate overall catalytic competence. Exploiting this observation, we design a new hyper-accurate Cas9 variant (HypaCas9) that demonstrates high genome-wide specificity without compromising on-target activity in human cells. These results offer a more comprehensive model to rationalize and modify the balance between target recognition and nuclease activation for precision genome editing.

A PAMless base editor CRISPR-Cas DNA base editing typically requires a specific motif for targeting known as a protospacer-adjacent motif (PAM). This requirement limits the sequences within a genome that can be targeted. Walton et al. engineered specific variants of the Streptococcus pyogenes Cas9 enzyme named SpG and SpRY that could recognize and edit a wider array of PAMs. Using SpRY, the authors were able to correct previously uneditable mutations associated with human disease. Although off-target effects were observed for these engineered Cas enzymes at levels similar to those of the wild-type enzyme, depending on the context, these engineered enzymes widen the potential applications of precision genome editing. Science , this issue p. 290

On-target activities and genome-wide specificities of Cpf1 nucleases in human cells. The activities and genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases1 are not well defined. We show that two Cpf1 nucleases from Acidaminococcus sp. BV3L6 and Lachnospiraceae bacterium ND2006 (AsCpf1 and LbCpf1, respectively) have on-target efficiencies in human cells comparable with those of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)2,3,4,5. We also report that four to six bases at the 3′ end of the short CRISPR RNA (crRNA) used to program Cpf1 nucleases are insensitive to single base mismatches, but that many of the other bases in this region of the crRNA are highly sensitive to single or double substitutions. Using GUIDE-seq and targeted deep sequencing analyses performed with both Cpf1 nucleases, we were unable to detect off-target cleavage for more than half of 20 different crRNAs. Our results suggest that AsCpf1 and LbCpf1 are highly specific in human cells.

CRISPR-Cas9 nucleases target specific DNA sequences using a guide RNA but also require recognition of a protospacer adjacent motif (PAM) by the Cas9 protein. Although longer PAMs can potentially improve the specificity of genome editing, they limit the range of sequences that Cas9 orthologs can target. One potential strategy to relieve this restriction is to relax the PAM recognition specificity of Cas9. Here we used molecular evolution to modify the NNGRRT PAM of Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9). One variant we identified, referred to as KKH SaCas9, showed robust genome editing activities at endogenous human target sites with NNNRRT PAMs, thereby increasing SaCas9 targeting range by two- to fourfold. Using GUIDE-seq, we show that wild-type and KKH SaCas9 induce comparable numbers of off-target effects in human cells. Our strategy for evolving PAM specificity does not require structural information and therefore should be applicable to a wide range of Cas9 orthologs.

Broad use of CRISPR–Cas12a (formerly Cpf1) nucleases1 has been hindered by the requirement for an extended TTTV protospacer adjacent motif (PAM)2. To address this limitation, we engineered an enhanced Acidaminococcus sp. Cas12a variant (enAsCas12a) that has a substantially expanded targeting range, enabling targeting of many previously inaccessible PAMs. On average, enAsCas12a exhibits a twofold higher genome editing activity on sites with canonical TTTV PAMs compared to wild-type AsCas12a, and we successfully grafted a subset of mutations from enAsCas12a onto other previously described AsCas12a variants3 to enhance their activities. enAsCas12a improves the efficiency of multiplex gene editing, endogenous gene activation and C-to-T base editing, and we engineered a high-fidelity version of enAsCas12a (enAsCas12a-HF1) to reduce off-target effects. Both enAsCas12a and enAsCas12a-HF1 function in HEK293T and primary human T cells when delivered as ribonucleoprotein (RNP) complexes. Collectively, enAsCas12a provides an optimized version of Cas12a that should enable wider application of Cas12a enzymes for gene and epigenetic editing. Structure-guided protein engineering of Cas12a yields variants that have increased activity and that can edit sites with previously inaccessible PAMs.

Abstract Adeno-associated virus (AAV) vectors have shown promising results in preclinical models, but the genomic consequences of transduction with AAV vectors encoding CRISPR-Cas nucleases is still being examined. In this study, we observe high levels of AAV integration (up to 47%) into Cas9-induced double-strand breaks (DSBs) in therapeutically relevant genes in cultured murine neurons, mouse brain, muscle and cochlea. Genome-wide AAV mapping in mouse brain shows no overall increase of AAV integration except at the CRISPR/Cas9 target site. To allow detailed characterization of integration events we engineer a miniature AAV encoding a 465 bp lambda bacteriophage DNA (AAV-λ465), enabling sequencing of the entire integrated vector genome. The integration profile of AAV-465λ in cultured cells display both full-length and fragmented AAV genomes at Cas9 on-target sites. Our data indicate that AAV integration should be recognized as a common outcome for applications that utilize AAV for genome editing.

Bacterial CRISPR-Cas systems protect their host from bacteriophages and other mobile genetic elements. Mobile elements, in turn, encode various anti-CRISPR (Acr) proteins to inhibit the immune function of CRISPR-Cas. To date, Acr proteins have been discovered for type I (subtypes I-D, I-E, and I-F) and type II (II-A and II-C) but not other CRISPR systems. Here, we report the discovery of 12 acr genes, including inhibitors of type V-A and I-C CRISPR systems. AcrVA1 inhibits a broad spectrum of Cas12a (Cpf1) orthologs-including MbCas12a, Mb3Cas12a, AsCas12a, and LbCas12a-when assayed in human cells. The acr genes reported here provide useful biotechnological tools and mark the discovery of acr loci in many bacteria and phages.