Background: With advances in sequencing technology and decreasing costs, the number of phage genomes that have been sequenced has increased markedly in the past decade. Materials and Methods: We developed an automated retrieval and analysis system for phage genomes (https://github.com/RyanCook94/inphared) to produce the INfrastructure for a PHAge REference Database (INPHARED) of phage genomes and associated metadata. Results: As of January 2021, 14,244 complete phage genomes have been sequenced. The INPHARED data set is dominated by phages that infect a small number of bacterial genera, with 75% of phages isolated on only 30 bacterial genera. There is further bias, with significantly more lytic phage genomes (∼70%) than temperate (∼30%) within our database. Collectively, this results in ∼54% of temperate phage genomes originating from just three host genera. With much debate on the carriage of antibiotic resistance genes and their potential safety in phage therapy, we searched for putative antibiotic resistance genes. Frequency of antibiotic resistance gene carriage was found to be higher in temperate phages than in lytic phages and again varied with host. Conclusions: Given the bias of currently sequenced phage genomes, we suggest to fully understand phage diversity, efforts should be made to isolate and sequence a larger number of phages, in particular temperate phages, from a greater diversity of hosts.

Abstract Background With advances in sequencing technology and decreasing costs, the number of bacteriophage genomes that have been sequenced has increased markedly in the last decade. Materials and Methods We developed an automated retrieval and analysis system for bacteriophage genomes, INPHARED ( https://github.com/RyanCook94/inphared ), that provides data in a consistent format. Results As of January 2021, 14,244 complete phage genomes have been sequenced. The data set is dominated by phages that infect a small number of bacterial genera, with 75% of phages isolated only on 30 bacterial genera. There is further bias with significantly more lytic phage genomes than temperate within the database, resulting in ~54% of temperate phage genomes originating from just three host genera. Within phage genomes, putative antibiotic resistance genes were found in higher frequencies in temperate phages than lytic phages. Conclusion We provide a mechanism to reproducibly extract complete phage genomes and highlight some of the biases within this data, that underpins our current understanding of phage genomes.

Abstract Viral metagenomics has fuelled a rapid change in our understanding of global viral diversity and ecology. Long-read sequencing and hybrid approaches that combine long and short read technologies are now being widely implemented in bacterial genomics and metagenomics. However, the use of long-read sequencing to investigate viral communities is still in its infancy. While Nanopore and PacBio technologies have been applied to viral metagenomics, it is not known to what extent different technologies will impact the reconstruction of the viral community. Thus, we constructed a mock phage community of previously sequenced phage genomes and sequenced using Illumina, Nanopore, and PacBio sequencing technologies and tested a number of different assembly approaches. When using a single sequencing technology, Illumina assemblies were the best at recovering phage genomes. Nanopore- and PacBio-only assemblies performed poorly in comparison to Illumina in both genome recovery and error rates, which both varied with the assembler used. The best Nanopore assembly had errors that manifested as SNPs and INDELs at frequencies ~4x and 120x higher than found in Illumina only assemblies respectively. While the best PacBio assemblies had SNPs at frequencies ~3.5 x and 12x higher than found in Illumina only assemblies respectively. Despite high read coverage, long-read only assemblies failed to recover a complete genome for any of the 15 phage, down sampling of reads did increase the proportion of a genome that could be assembled into a single contig. Overall the best approach was assembly by a combination of Illumina and Nanopore reads, which reduced error rates to levels comparable with short read only assemblies. When using a single technology, Illumina only was the best approach. The differences in genome recovery and error rates between technology and assembler had downstream impacts on gene prediction, viral prediction, and subsequent estimates of diversity within a sample. These findings will provide a starting point for others in the choice of reads and assembly algorithms for the analysis of viromes. Data Summary All reads from virome sequencing were submitted to the ENA under study PRJEB56639. The assemblies are provided via FigShare ( https://figshare.com/s/2d9b5121eb421d370455 ). Author Notes Eight Supplementary Tables and nine Supplementary Figures are available with the online version of this article.

Abstract Antimicrobial resistance (AMR) is a major problem globally. The main bacterial organisms associated with urinary tract infection (UTI) associated sepsis are E. coli and Klebsiella along with Enterobacter species. These all have AMR strains known as ESBL (Extended Spectrum Beta-Lactamase), which are featured on the WHO priority pathogens list as ‘critical’ for research. Bacteriophages (phages) as viruses that can infect and kill bacteria, could provide an effective tool to tackle these AMR strains. There is currently no ‘gold standard’ for developing a phage cocktail. Here we describe a novel approach to develop an effective phage cocktail against a set of ESBL-producing E. coli and Klebsiella largely isolated from patients in UK hospitals. By comparing different measures of phage efficacy, we show which are the most robust, and suggest an efficient screening cascade that could be used to develop phage cocktails to target other AMR bacterial species. A target panel of 38 ESBL-producing clinical strains isolated from urine samples was collated and used to test phage efficacy. After an initial screening of 68 phages, six were identified and tested against these 38 strains to determine their clinical coverage and killing efficiency. To achieve this, we assessed four different methods to assess phage virulence across these bacterial isolates. These were the Direct Spot Test (DST), the Efficiency of Plating (EOP) assay, the planktonic killing assay and the biofilm assay. The final ESBL cocktail of six phages could effectively kill 23/38 strains (61%) for Klebsiella 13/19 (68%) and for E. coli 10/19 (53%) based on the planktonic killing assay data. The ESBL E. coli collection had six isolates from the prevalent UTI-associated ST131 sequence type, five of which were targeted effectively by the final cocktail. Of the four methods used to assess phage virulence, the data suggests that planktonic killing assays are as effective as the much more time-consuming EOPs and data for the two assays correlates well. This suggests that planktonic killing is a good proxy to determine which phages should be used in a cocktail. This assay when combined with the virulence index also allows ‘phage synergy’ to inform cocktail design.