Using fluorescence in situ hybridization we show striking differences in nuclear position, chromosome morphology, and interactions with nuclear substructure for human chromosomes 18 and 19. Human chromosome 19 is shown to adopt a more internal position in the nucleus than chromosome 18 and to be more extensively associated with the nuclear matrix. The more peripheral localization of chromosome 18 is established early in the cell cycle and is maintained thereafter. We show that the preferential localization of chromosomes 18 and 19 in the nucleus is reflected in the orientation of translocation chromosomes in the nucleus. Lastly, we show that the inhibition of transcription can have gross, but reversible, effects on chromosome architecture. Our data demonstrate that the distribution of genomic sequences between chromosomes has implications for nuclear structure and we discuss our findings in relation to a model of the human nucleus that is functionally compartmentalized.

The nuclear lamina (NL) interacts with hundreds of large genomic regions termed lamina associated domains (LADs). The dynamics of these interactions and the relation to epigenetic modifications are poorly understood. We visualized the fate of LADs in single cells using a "molecular contact memory" approach. In each nucleus, only ∼30% of LADs are positioned at the periphery; these LADs are in intermittent molecular contact with the NL but remain constrained to the periphery. Upon mitosis, LAD positioning is not detectably inherited but instead is stochastically reshuffled. Contact of individual LADs with the NL is linked to transcriptional repression and H3K9 dimethylation in single cells. Furthermore, we identify the H3K9 methyltransferase G9a as a regulator of NL contacts. Collectively, these results highlight principles of the dynamic spatial architecture of chromosomes in relation to gene regulation.

Background: In comparison with many nuclear proteins, the movement of chromatin in nuclei appears to be generally constrained. These restrictions on motion are proposed to reflect the attachment of chromatin to immobile nuclear substructures.Results: To gain insight into the regulation of chromosome dynamics by nuclear architecture, we have followed the movements of different sites in the human genome in living cells. Here, we show that loci at nucleoli or the nuclear periphery are significantly less mobile than other, more nucleoplasmic loci. Disruption of nucleoli increases the mobility of nucleolar-associated loci.Conclusions: This is the first report of distinct nuclear substructures constraining the movements of chromatin. These constraints reflect the physical attachment of chromatin to nuclear compartments or steric impairment caused by local ultrastructure. Our data suggest a role for the nucleolus and nuclear periphery in maintaining the three-dimensional organization of chromatin in the human nucleus.

The spatial organisation of the genome in the nucleus has a role in the regulation of gene expression. In vertebrates, chromosomal regions with low gene-density are located close to the nuclear periphery. Correlations have also been made between the transcriptional state of some genes and their location near the nuclear periphery. However, a crucial issue is whether this level of nuclear organisation directly affects gene function, rather than merely reflecting it. To directly investigate whether proximity to the nuclear periphery can influence gene expression in mammalian cells, here we relocate specific human chromosomes to the nuclear periphery by tethering them to a protein of the inner nuclear membrane. We show that this can reversibly suppress the expression of some endogenous human genes located near the tethering sites, and even genes further away. However, the expression of many other genes is not detectably reduced and we show that location at the nuclear periphery is not incompatible with active transcription. The dampening of gene expression around the nuclear periphery is dependent on the activity of histone deacetylases. Our data show that the radial position within the nucleus can influence the expression of some, but not all, genes. This is compatible with the suggestion that re-localisation of genes relative to the peripheral zone of the nucleus could be used by metazoans to modulate the expression of selected genes during development and differentiation.

How polycomb group proteins repress gene expression in vivo is not known. While histone-modifying activities of the polycomb repressive complexes (PRCs) have been studied extensively, in vitro data have suggested a direct activity of the PRC1 complex in compacting chromatin. Here, we investigate higher-order chromatin compaction of polycomb targets in vivo. We show that PRCs are required to maintain a compact chromatin state at Hox loci in embryonic stem cells (ESCs). There is specific decompaction in the absence of PRC2 or PRC1. This is due to a PRC1-like complex, since decompaction occurs in Ring1B null cells that still have PRC2-mediated H3K27 methylation. Moreover, we show that the ability of Ring1B to restore a compact chromatin state and to repress Hox gene expression is not dependent on its histone ubiquitination activity. We suggest that Ring1B-mediated chromatin compaction acts to directly limit transcription in vivo.

We present an analysis of chromatin fiber structure across the human genome. Compact and open chromatin fiber structures were separated by sucrose sedimentation and their distributions analyzed by hybridization to metaphase chromosomes and genomic microarrays. We show that compact chromatin fibers originate from some sites of heterochromatin (C-bands), and G-bands (euchromatin). Open chromatin fibers correlate with regions of highest gene density, but not with gene expression since inactive genes can be in domains of open chromatin, and active genes in regions of low gene density can be embedded in compact chromatin fibers. Moreover, we show that chromatin fiber structure impacts on further levels of chromatin condensation. Regions of open chromatin fibers are cytologically decondensed and have a distinctive nuclear organization. We suggest that domains of open chromatin may create an environment that facilitates transcriptional activation and could provide an evolutionary constraint to maintain clusters of genes together along chromosomes.

The presence of ribonucleotides in genomic DNA is undesirable given their increased susceptibility to hydrolysis. Ribonuclease (RNase) H enzymes that recognize and process such embedded ribonucleotides are present in all domains of life. However, in unicellular organisms such as budding yeast, they are not required for viability or even efficient cellular proliferation, while in humans, RNase H2 hypomorphic mutations cause the neuroinflammatory disorder Aicardi-Goutières syndrome. Here, we report that RNase H2 is an essential enzyme in mice, required for embryonic growth from gastrulation onward. RNase H2 null embryos accumulate large numbers of single (or di-) ribonucleotides embedded in their genomic DNA (>1,000,000 per cell), resulting in genome instability and a p53-dependent DNA-damage response. Our findings establish RNase H2 as a key mammalian genome surveillance enzyme required for ribonucleotide removal and demonstrate that ribonucleotides are the most commonly occurring endogenous nucleotide base lesion in replicating cells.

Highlights•Super-resolution microscopy reveals increased enhancer-promoter separation upon activation•Synthetic enhancer activation supports decreased enhancer-promoter proximity•Enhancer-promoter separation can be driven by poly(ADP-ribose) polymerase 1SummaryEnhancers can regulate the promoters of their target genes over very large genomic distances. It is widely assumed that mechanisms of enhancer action involve the reorganization of three-dimensional chromatin architecture, but this is poorly understood. The predominant model involves physical enhancer-promoter interaction by looping out the intervening chromatin. However, studying the enhancer-driven activation of the Sonic hedgehog gene (Shh), we have identified a change in chromosome conformation that is incompatible with this simple looping model. Using super-resolution 3D-FISH and chromosome conformation capture, we observe a decreased spatial proximity between Shh and its enhancers during the differentiation of embryonic stem cells to neural progenitors. We show that this can be recapitulated by synthetic enhancer activation, is impeded by chromatin-bound proteins located between the enhancer and the promoter, and appears to involve the catalytic activity of poly (ADP-ribose) polymerase. Our data suggest that models of enhancer-promoter communication need to encompass chromatin conformations other than looping.Graphical abstract

During differentiation, thousands of genes are repositioned toward or away from the nuclear envelope. These movements correlate with changes in transcription and replication timing. Using synthetic (TALE) transcription factors, we found that transcriptional activation of endogenous genes by a viral trans-activator is sufficient to induce gene repositioning toward the nuclear interior in embryonic stem cells. However, gene relocation was also induced by recruitment of an acidic peptide that decondenses chromatin without affecting transcription, indicating that nuclear reorganization is driven by chromatin remodeling rather than transcription. We identified an epigenetic inheritance of chromatin decondensation that maintained central nuclear positioning through mitosis even after the TALE transcription factor was lost. Our results also demonstrate that transcriptional activation, but not chromatin decondensation, is sufficient to change replication timing.

Although important for gene regulation, most studies of genome organization use either fluorescence in situ hybridization (FISH) or chromosome conformation capture (3C) methods. FISH directly visualizes the spatial relationship of sequences but is usually applied to a few loci at a time. The frequency at which sequences are ligated together by formaldehyde cross-linking can be measured genome-wide by 3C methods, with higher frequencies thought to reflect shorter distances. FISH and 3C should therefore give the same views of genome organization, but this has not been tested extensively. We investigated the murine HoxD locus with 3C carbon copy (5C) and FISH in different developmental and activity states and in the presence or absence of epigenetic regulators. We identified situations in which the two data sets are concordant but found other conditions under which chromatin topographies extrapolated from 5C or FISH data are not compatible. We suggest that products captured by 3C do not always reflect spatial proximity, with ligation occurring between sequences located hundreds of nanometers apart, influenced by nuclear environment and chromatin composition. We conclude that results obtained at high resolution with either 3C methods or FISH alone must be interpreted with caution and that views about genome organization should be validated by independent methods.