ABSTRACT Bats are reservoir hosts for many zoonotic viruses. Despite this, relatively little is known about the diversity and abundance of viruses within bats at the level of individual animals, and hence the frequency of virus co-infection and inter-species transmission. Using an unbiased meta-transcriptomics approach we characterised the mammalian associated viruses present in 149 individual bats sampled from Yunnan province, China. This revealed a high frequency of virus co-infection and species spillover among the animals studied, with 12 viruses shared among different bat species, which in turn facilitates virus recombination and reassortment. Of note, we identified five viral species that are likely to be pathogenic to humans or livestock, including a novel recombinant SARS-like coronavirus that is closely related to both SARS-CoV-2 and SARS-CoV, with only five amino acid differences between its receptor-binding domain sequence and that of the earliest sequences of SARS-CoV-2. Functional analysis predicts that this recombinant coronavirus can utilize the human ACE2 receptor such that it is likely to be of high zoonotic risk. Our study highlights the common occurrence of inter-species transmission and co-infection of bat viruses, as well as their implications for virus emergence.

ABSTRACT Mosquito transmitted viruses are responsible for an increasing burden of human disease. Despite this, little is known about the diversity and ecology of viruses within individual mosquito hosts. Using a meta-transcriptomic approach, we analysed the virome of 2,438 individual mosquitos (79 species), spanning ∼4000 km along latitudes and longitudes in China. From these data we identified 393 core viral species associated with mosquitos, including seven (putative) arbovirus species. We identified potential species and geographic hotspots of viral richness and arbovirus occurrence, and demonstrated that host phylogeny had a strong impact on the composition of individual mosquito viromes. Our data revealed a large number of viruses shared among mosquito species or genera, expanding our knowledge of host specificity of insect-associated viruses. We also detected multiple virus species that were widespread throughout the country, possibly facilitated by long-distance mosquito migrations. Together, our results greatly expand the known mosquito virome, linked the viral diversity at the scale of individual insects to that at a country-wide scale, and offered unique insights into the ecology of viruses of insect vectors.

Abstract Tilapia lake virus (TiLV) has caused mass mortalities in farmed and wild tilapia with serious economic and ecological consequences. Until recently, this virus was the sole member of the Amnoonviridae , a family within the order Articulavirales comprising segmented negative-sense RNA viruses. We sought to identify additional viruses within the Amnoonviridae through total RNA sequencing (meta-transcriptomics) and data mining of published transcriptomes. Accordingly, we sampled marine fish species from both Australia and China and discovered two new viruses within the Amnoonviridae , tentatively called Flavolineata virus and Piscibus virus , respectively. In addition, by mining vertebrate transcriptome data we identified nine additional virus transcripts matching to multiple genomic segments of TiLV in both marine and freshwater fish. These new viruses retained sequence conservation with the distantly related Orthomyxoviridae in the RdRp subunit PB1, but formed a distinct and diverse phylogenetic group. These data suggest that the Amnoonviridae have a broad host range within fish and that greater animal sampling will identify additional divergent members of the Articulavirales .

Abstract The RNA virus family Flaviviridae harbours several important pathogens of humans and other animals, including Zika virus, dengue virus and hepatitis C virus. The Flaviviridae are currently divided into four genera - Hepacivirus , Pegivirus , Pestivirus and Flavivirus – each of which have a diverse host range. Members of the genus Hepacivirus are associated with a diverse array of animal species, including humans and non-human primates, other mammalian species, as well as birds and fish, while the closely related pegiviruses have been identified in a variety of mammalian taxa including humans. Using a combination of meta-transcriptomic and whole genome sequencing we identified four novel hepaciviruses and one novel variant of a known virus, in five species of native Australian wildlife, expanding our knowledge of the diversity in this important group of RNA viruses. The infected hosts comprised native Australian marsupials and birds, as well as a native gecko ( Gehyra lauta ). The addition of these novel viruses led to the identification of a distinct marsupial clade within the hepacivirus phylogeny that also included an engorged Ixodes holocyclus tick collected while feeding on Australian long-nosed bandicoots ( Perameles nasuta ). Gecko and avian associated hepacivirus lineages were also identified. In addition, by mining the short-read archive (SRA) database we identified another five novel members of Flaviviridae , comprising three new hepaciviruses from avian and primate hosts, as well as two primate-associated pegiviruses. The large-scale phylogenetic analysis of these novel hepacivirus and pegivirus genomes provides additional support for virus-host co-divergence over evolutionary time-scales.

Abstract Game animals are wildlife species often traded and consumed as exotic food, and are potential reservoirs for SARS-CoV and SARS-CoV-2. We performed a meta-transcriptomic analysis of 1725 game animals, representing 16 species and five mammalian orders, sampled across China. From this we identified 71 mammalian viruses, with 45 described for the first time. Eighteen viruses were considered as potentially high risk to humans and domestic animals. Civets ( Paguma larvata ) carried the highest number of potentially high risk viruses. We identified the transmission of Bat coronavirus HKU8 from a bat to a civet, as well as cross-species jumps of coronaviruses from bats to hedgehogs and from birds to porcupines. We similarly identified avian Influenza A virus H9N2 in civets and Asian badgers, with the latter displaying respiratory symptoms, as well as cases of likely human-to-wildlife virus transmission. These data highlight the importance of game animals as potential drivers of disease emergence. Highlights 1725 game animals from five mammalian orders were surveyed for viruses 71 mammalian viruses were discovered, 18 with a potential risk to humans Civets harbored the highest number of potential ‘high risk’ viruses A species jump of an alphacoronavirus from bats to a civet was identified H9N2 influenza virus was detected in a civet and an Asian badger Humans viruses were also identified in game animals

Abstract Host age influences the ecology of many microorganisms. This is evident in one-host – one virus systems, such as influenza A virus in Mallards, but also in community studies of parasites and microbiomes. We used a meta-transcriptomic approach to assess whether host age is associated with differences in the abundance and diversity of avian viromes. We used samples from cohabiting Ruddy Turnstones ( Arenaria interpres ) across three age groups, collected at two contrasting points in their annual migratory cycle. Overall, we identified 14 viruses that likely infect birds, 11 of which were novel, including members of the Reoviridae , Astroviridae , Picornaviridae , and Phenuiviridae . Strikingly, 12 of the viruses identified were from juvenile birds sampled in the first year of their life, compared to only two viruses in adult birds. Similarly, both viral abundance and alpha diversity were higher in juvenile than adult birds. Notably, time of sampling had no association with virome structure such that the migratory period may not play a major role in structuring avian viromes. As well as informing studies of virus ecology, that host age impacts viral assemblages is a critical consideration for the future surveillance of novel and emerging viruses.

Hepatitis delta virus (HDV) is the smallest known RNA virus and encodes a single protein. Until recently, HDV had only been identified in humans, where it is strongly associated with co-infection with hepatitis B virus (HBV). However, the recent discovery of HDV-like viruses in metagenomic samples from birds and snakes suggests that this virus has a far longer evolutionary history. Herein, using additional meta-transcriptomic data, we show that highly divergent HDV-like viruses are also present in fish, amphibians and invertebrates. Notably, the novel viruses identified here share HDV-like genomic features such as a small genome size of ~1.7kb in length, circular genomes, and self-complementary, unbranched rod-like structures. Coiled-coil domains, leucine zippers, conserved residues with essential biological functions and isoelectronic points similar to those in the human hepatitis delta virus antigens (HDAgs) were also identified in the putative non-human HDAgs. Notably, none of these novel HDV-like viruses were associated with hepadnavirus infection, supporting the idea that the HDV-HBV association may be specific to humans. Collectively, these data not only broaden our understanding of the diversity and host range of HDV in non-human species, but shed light on its origin and evolutionary history.

Antibiotic resistance is rendering common bacterial infections untreatable. Wildlife can incorporate and disperse antibiotic resistant bacteria in the environment, such as water systems, which in turn serve as reservoirs of resistance genes for human pathogens. We used bulk RNA-sequencing (meta-transcriptomics) to assess the diversity and expression levels of functionally active resistance genes in the microbiome of birds with aquatic behavior. We sampled birds across a range of habitats, from penguins in Antarctica to ducks in a wastewater treatment plant in Australia. This revealed 81 antibiotic resistance genes in birds from all localities, including β-lactam, tetracycline and chloramphenicol resistance in Antarctica, and genes typically associated with multidrug resistance plasmids in areas with high human impact. Notably, birds feeding at a wastewater treatment plant carried the greatest resistance gene burden, suggesting that human waste, even if it undergoes treatment, contributes to the spread of antibiotic resistance genes to the wild. Differences in resistance gene burden also reflected the birds' ecology, taxonomic group and microbial functioning. Ducks, which feed by dabbling, carried a higher abundance and diversity of resistance genes than turnstones, avocets and penguins, that usually prey on more pristine waters. In sum, this study helps to reveal the complex factors explaining the distribution of resistance genes and their exchange routes between humans and wildlife.

Abstract SARS-CoV Spike (S) protein shares considerable homology with SARS-CoV-2 S, especially in the conserved S2 subunit (S2). S protein mediates coronavirus receptor binding and membrane fusion, and the latter activity can greatly influence coronavirus infection. We observed that SARS-CoV S is less effective in inducing membrane fusion compared with SARS-CoV-2 S. We identify that S813T mutation is sufficient in S2 interfering with the cleavage of SARS-CoV-2 S by TMPRSS2, reducing spike fusogenicity and pseudoparticle entry. Conversely, the mutation of T813S in SARS-CoV S increased fusion ability and viral replication. Our data suggested that residue 813 in the S was critical for the proteolytic activation, and the change from threonine to Serine at 813 position might be an evolutionary feature adopted by SARS-2-related viruses. This finding deepened the understanding of Spike fusogenicity and could provide a new perspective for exploring Sarbecovirus ’ evolution. Author Summary The Spike strain of SARS-CoV-2 has accumulated many mutations during its time in circulation, most of which have occurred in the S1 region, and more specifically in the RBD, in an effort to either improve the virus’s affinity for the receptor ACE2 or to enhance its ability to evade the immune system. Mutations in the Spike S2 region have more far-reaching effects than those in the S1 region because it is more conserved across sarbecoviruses. By comparing SARS and SARS2, we found that an important substitution at amino acid position 813 in the S2 region (T813S) disrupts the utilization of TMPRSS2 and can significantly influence viral entry into cells. This discovery deepens our knowledge of S proteins and provides new prospects for tracing the evolution of Sarbecoviruses.

Our knowledge of mammalian viruses has been strongly skewed toward those that cause disease in humans and animals. However, recent metagenomic studies indicate that most apparently healthy organisms carry viruses, and that these seemingly benign viruses may comprise the bulk of virus diversity. The bias toward studying viruses associated with overt disease is apparent in the lagoviruses (family Caliciviridae) that infect rabbits and hares: although most attention has been directed toward the highly pathogenic members of this genus - the rabbit haemorrhagic disease virus and European brown hare syndrome virus - a number of benign lagoviruses have also been identified. To determine whether wild European brown hares in Australia might also carry undetected benign viruses, we used a meta-transcriptomics approach to explore the gut and liver RNA viromes of these invasive animals. This led to the discovery of three new lagoviruses. While one of the three viruses was only detected in a single hare, the other two viruses were detected in 20% of all hares tested. All three viruses were most closely related to other hare lagoviruses, but were highly distinct from both known viruses and each other. We also found evidence for complex recombination events in these viruses, which, combined with their phylogenetic distribution, suggests that there is likely extensive unsampled diversity in this genus. Additional metagenomic studies of hares and other species are clearly needed to fill gaps in the lagovirus phylogeny and hence better understand the evolutionary history of this important group of mammalian viruses.