Abstract Mycobacterium tuberculosis lung infection results in a complex multicellular structure, the granuloma. In some granulomas, immune activity promotes bacterial clearance; in others, bacteria persist and grow. We identified correlates of bacterial control in cynomolgus macaque lung granulomas by co-registering longitudinal PET-CT imaging, single-cell RNA-sequencing, and measures of bacterial clearance. We find that bacterial persistence occurs in granulomas enriched for mast, endothelial, fibroblast and plasma cells, signaling amongst themselves via Type II immunity and wound healing pathways. In contrast, these interactions are largely absent in granulomas that drive bacterial control, which are often those that form later in the course of infection; these restrictive lesions are characterized by cellular ecosystems enriched for Type1-Type17, stem-like, and cytotoxic T cells engaged in pro-inflammatory signaling networks that involve diverse myeloid and non-immune cell populations. There is also a temporal aspect to bacterial control, in that granulomas that arise later in infection (in the context of an established immune response) share the functional characteristics of restrictive granulomas and are more capable of killing Mtb. Taken together, our results define the complex multicellular ecosystems underlying (lack of) granuloma resolution and highlight host immune targets that can be leveraged to develop new vaccine and therapeutic strategies for TB. One-Sentence Summary Bacterial control in TB lung granulomas correlates with distinct cellular immune microenvironments and time of formation after infection.

Idiopathic aplastic anemia is a potentially lethal disease, characterized by T cell-mediated autoimmune attack of bone marrow hematopoietic stem cells. Standard of care therapies (stem cell transplantation or immunosuppression) are effective but associated with a risk of serious toxicities.An 18-year-old man presented with aplastic anemia in the context of a germline gain-of-function variant in STAT1. Treatment with the JAK1 inhibitor itacitinib resulted in a rapid resolution of aplastic anemia and a sustained recovery of hematopoiesis. Peripheral blood and bone marrow samples were compared before and after JAK1 inhibitor therapy.Following therapy, samples showed a decrease in the plasma concentration of interferon-γ, a decrease in PD1-positive exhausted CD8+ T cell population, and a decrease in an interferon responsive myeloid population. Single-cell analysis of chromatin accessibility showed decreased accessibility of STAT1 across CD4+ and CD8+ T cells, as well as CD14+ monocytes. To query whether other cases of aplastic anemia share a similar STAT1-mediated pathophysiology, we examined a cohort of 9 patients with idiopathic aplastic anemia. Bone marrow from six of nine patients also displayed abnormal STAT1 hyper-activation.These findings raise the possibility that STAT1 hyperactivition defines a subset of idiopathic aplastic anemia patients for whom JAK inhibition may be an efficacious therapy.Funding was provided by the Massachusetts General Hospital Department of Medicine Pathways Program and NIH T32 AI007387. A trial registration is at https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03906318.

SUMMARY Monocytes, dendritic cells, and macrophages, commonly referred to as mononuclear phagocytes (MNPs), are innate immune cells capable of adopting diverse homeostatic and pathogenic phenotypes. Recent single-cell RNA-sequencing studies across many diseases in the lung have profiled this diversity transcriptionally, defining new cellular states and their association with disease. Despite these massive cellular profiling efforts, many studies have focused on defining myeloid dysfunction in specific diseases without identifying common pan-disease trends in the mononuclear phagocyte compartment within the lung. To address these gaps in our knowledge, we collate, process, and analyze 561,390 cellular transcriptomes from 12 studies of the human lung across multiple human diseases. We develop a computational framework to identify and compare dominant gene markers and gene expression programs and characterize MNP diversity in the lung, proposing a conserved dictionary of gene sets. Utilizing this reference, we efficiently identify disease-associated and rare MNP populations across multiple diseases and cohorts. Furthermore, we demonstrate the utility of this dictionary in characterizing a recently published dataset of bronchoalveolar lavage cells from COVID-19 patients and healthy controls which further reveal novel transcriptional shifts directly relatable to other diseases in the lung. These results underline conserved MNP transcriptional programs in lung disease, provide an immediate reference for characterizing the landscape of lung MNPs and establish a roadmap to dissecting MNP transcriptional complexity across tissues.

ABSTRACT Novel vaccination and therapeutic strategies are urgently needed to mitigate the tuberculosis (TB) epidemic. While extensive efforts have focused on potentiating cell-mediated immunity to control Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) infection, less effort has been invested in exploiting the humoral immune system to combat Mtb . Emerging data point to a role for antibodies in microbial control of Mtb , however the precise mechanism(s) of this control remain incompletely understood. Here we took an antibody Fc-engineering approach to determine whether Fc-modifications could improve the ability of antibodies to restrict Mtb , and to define Fc-mediated mechanism(s) antibodies leverage for this restriction. Using an antibody specific to the capsular polysaccharide α-glucan, we engineer a panel of Fc variants to augment or dampen select antibody effector functions, rationally building antibodies with enhanced capacity to promote Mtb restriction in a human whole blood model of infection. Surprisingly, restrictive Fc-engineered antibodies drive Mtb control in a neutrophil, not monocyte, dependent manner. Using single cell RNA sequencing, we show that restrictive antibodies promote neutrophil survival and expression of cell intrinsic antimicrobial programs. These data provide a roadmap for exploiting Fc-engineered antibodies as a novel class of TB therapeutics able to harness the protective functions of neutrophils to achieve disease control.

Summary Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) causes 1.6 million deaths annually. Active tuberculosis correlates with a neutrophil-driven type I interferon (IFN) signature, but the cellular mechanisms underlying tuberculosis pathogenesis remain poorly understood. We found interstitial macrophages (IMs) and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are dominant producers of type I IFN during Mtb infection in mice and non-human primates, and pDCs localize near human Mtb granulomas. Depletion of pDCs reduces Mtb burdens, implicating pDCs in tuberculosis pathogenesis. During IFN-driven disease, we observe abundant DNA-containing neutrophil extracellular traps (NETs) known to activate pDCs. Cell type-specific disruption of the type I IFN receptor suggests IFNs act on IMs to inhibit Mtb control. Single cell RNA-seq indicates type I IFN-responsive cells are defective in their response to IFN γ , a cytokine critical for Mtb control. We propose pDC-derived type I IFNs act on IMs to drive bacterial replication, further neutrophil recruitment, and active tuberculosis disease.

Abstract Mammalian cells adapt their functional state in response to external signals in form of ligands that bind receptors on the cell-surface. Mechanistically, this involves signal-processing through a complex network of molecular interactions that govern transcription factor (TF) activity patterns. Computer simulations of the information flow through this network could help predict cellular responses in health and disease. Here we develop a recurrent neural network constrained by prior knowledge of the signaling network with ligand concentrations as input, TF activity as output and signaling molecules as hidden nodes. Simulations are assumed to reach steady state, and we regularize the parameters to enforce this. Using synthetic data, we train models that generalize to unseen data and predict the effects of gene knockouts. We also fit models to a small experimental data set from literature and confirm the predictions using cross validation. This demonstrates the feasibility of simulating intracellular signaling at the genome-scale.

Although co-stimulation of T cells with agonist antibodies targeting 4-1BB (CD137) improves antitumor immune responses in preclinical studies, clinical development has been hampered by on-target, off-tumor toxicity. Here, we report the development of a tumor-anchored ɑ4-1BB agonist (ɑ4-1BB-LAIR), which consists of an ɑ4-1BB antibody fused to the collagen binding protein LAIR. While combination treatment with an antitumor antibody (TA99) displayed only modest efficacy, simultaneous depletion of CD4+ T cells boosted cure rates to over 90% of mice. We elucidated two mechanisms of action for this synergy: ɑCD4 eliminated tumor draining lymph node Tregs, enhancing priming and activation of CD8+ T cells, and TA99 + ɑ4-1BB-LAIR supported the cytotoxic program of these newly primed CD8+ T cells within the tumor microenvironment. Replacement of ɑCD4 with ɑCTLA-4, a clinically approved antibody that enhances T cell priming, produced equivalent cure rates while additionally generating robust immunological memory against secondary tumor rechallenge.

Meiotic drive elements like Spore killer 2 (Sk-2) in Neurospora are transmitted through sexual reproduction to the next generation in a biased manner. Sk-2 achieves this biased transmission through spore killing. Here, we identify rfk-1 as a gene required for the spore killing mechanism. The rfk-1 gene is associated with a 1,481 bp DNA interval (called AH36) near the right border of the 30 cM Sk-2 element, and its deletion eliminates the ability of Sk-2 to kill spores. The rfk-1 gene also appears to be sufficient for spore killing because its insertion into a non-Sk-2 isolate disrupts sexual reproduction after the initiation of meiosis. Although the complete rfk-1 transcript has yet to be defined, our data indicate that rfk-1 encodes a protein of at least 39 amino acids and that rfk-1 has evolved from a partial duplication of gene ncu07086. We also present evidence that rfk-1's location near the right border of Sk-2 is critical for the success of spore killing. Increasing the distance of rfk-1 from the right border of Sk-2 causes it to be inactivated by a genome defense process called meiotic silencing by unpaired DNA (MSUD), adding to accumulating evidence that MSUD exists, at least in part, to protect genomes from meiotic drive.

Mounting evidence indicates that antibodies can contribute towards control of tuberculosis (TB). However, the underlying mechanisms of humoral immune protection and whether antibodies can be exploited in therapeutic strategies to combat TB are relatively understudied. Here we engineered the receptor-binding Fc (fragment crystallizable) region of an antibody recognizing the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) capsule, to define antibody Fc-mediated mechanism(s) of Mtb restriction. We generated 52 Fc variants that either promote or inhibit specific antibody effector functions, rationally building antibodies with enhanced capacity to promote Mtb restriction in a human whole-blood model of infection. While there is likely no singular Fc profile that universally drives control of Mtb, here we found that several Fc-engineered antibodies drove Mtb restriction in a neutrophil-dependent manner. Single-cell RNA sequencing analysis showed that a restrictive Fc-engineered antibody promoted neutrophil survival and expression of cell-intrinsic antimicrobial programs. These data show the potential of Fc-engineered antibodies as therapeutics able to harness the protective functions of neutrophils to promote control of TB. Fc engineering of a capsule-specific antibody identifies Fc variants which augment effector function and promote neutrophil-dependent control of Mycobacterium tuberculosis.

ABSTRACT Myeloid cells are key constituents of tuberculosis (TB) granulomas. They are the major target of pathogen infection and play central roles in pathogen control, antigen presentation, adaptive immune cell recruitment, and tissue homeostasis. However, the role of myeloid cells in TB has been studied largely through ex vivo experimental approaches that do not capture the dynamic phenotypic and functional states of these cells in the disease environment. To address this gap, we used a combination of bulk and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), computational modeling, and imaging to define the molecular diversity of myeloid cells in granulomas from Mycobacterium tuberculosis -infected nonhuman primates. We observed an increase in myeloid cell diversity in granulomas compared to non-granulomatous lung tissue. This increased transcriptional diversity is defined by a continuum of macrophage differentiation-, metabolism-, and cytokine-regulated transcriptional programs. In vitro experimental modeling of monocyte-to-macrophage differentiation in defined cytokine environments implicates differentiation time, IFN-γ, and TGF-β signaling as candidate drivers of macrophage diversity. We next examined the conservation of these populations across additional experimental models of Mtb infection and found myeloid cell subsets enriched across the TB disease spectrum. To further contextualize these responses, we constructed an atlas of myeloid cells across diverse human lung pathologies, finding myeloid cell subpopulations that were similar between TB and other lung pathologies as well as subpopulations that distinguish between diseases. Collectively, this study identifies points of integration between myeloid cell biology in TB granulomas and other lung diseases that can be used for defining the signals that instruct myeloid cell behavior in TB and other diseases, as well as advance myeloid cell-targeted therapies.